不同灸量小艾炷灸肝俞穴对原发性肝癌模型大鼠癌前病变期TNF-α、AFP的影响

王 宁,谭 丽,侯中伟

(1.中山大学附属第七医院,广东 深圳 518107; 2.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510006;3.北京中医药大学，北京 100029)

原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是起源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤。2012年，全球范围内男性肝癌的发病率和死亡率分居第5位和第2位，女性肝癌的发病率和死亡率分居第7位和第6位[1]。中国肝癌死亡率分别占同期全球第3位，同期中国死亡38万人，占同期中国癌症死亡总数的17.4%[2]。2013年我国仍有36.2万人确诊肝癌[3]。因此，降低原发性肝癌的发病率和死亡率在肝癌防治过程中起着关键的作用。在临床研究中发现[4-5]，艾灸在治疗肝病进程中存在着明确的临床疗效。故本实验在采用二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)建立HCC肝癌模型的同时，用不同灸量的小艾炷干预模型大鼠，观察艾灸肝俞穴对HCC模型癌前病变期大鼠血清中肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、甲胎蛋白(Alphafetoprotein,AFP)含量的影响以及肝脏组织病理形态学的变化，比较不同灸量之间的效果差异，寻求最佳灸量。

1 材料

1.1 实验动物及分组

55只清洁级Wistar雄性大鼠,体质量(200±10)g，在实验前适应性饲养1周后，按随机数字表法分为对照组(10只)、模型组(15只)、艾灸1组(15只)、艾灸2组(15只)。在整个实验过程中，大鼠均饲养于温度为20℃～25℃湿度为55%左右的动物房。实验用大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK京2012-0001。

1.2 主要试剂、药品和设备

试剂：苏木素-伊红(HE)染色液(北京普利莱基因技术有限公司)，TNF-α、AFP检测试剂盒(北京环宇金科生物医学技术有限公司)；药品：麻醉剂采用浓度为1.5%的戊巴比妥钠,DEN溶液(浓度为0.95 g/mL，购于美国Sigma公司，批号Sigma-N0756)；仪器：AnymicroDSSTM图像采集系统和德国LEICARM2245型石蜡切片机；艾绒(型号：80:1)。

1.3 模型制备

本实验采用DEN腹腔注射法复制HCC模型[6]。首先将浓度为0.95 g/mL的DEN溶液溶于0.9% Nacl溶液中，配制成浓度为10 mg/mL的溶液。然后根据大鼠体质量，按照50 mg/kg的剂量进行腹腔注射。注射频次为：2次/周，期间间隔3～4天或84 h，连续10周。HCC模型造模成功的主要标志为肝脏病理组织切片可见肝小叶结构完全破坏，肝板消失，细胞核深染，核/质比增大，异型性增加，部分出现核固缩和核碎裂现象，局部诱导出肿瘤灶；解剖可见肝脏质地变硬，体积明显萎缩变小，表面出现大量大小不一的结节，或见腹水，或见肺部及胃部出现转移灶；形态出现形体消瘦、体重减轻、行动迟缓等。

2 方法

2.1 干预方法

模型组和对照组大鼠只做固定处理，不做艾灸。艾灸1组、艾灸2组的大鼠注射完浓度为10 mg/mL的DEN溶液后，固定于动物台上，采用小艾炷灸肝俞穴，分别按照3壮/穴、6壮/穴的灸量进行干预，每隔1日1次，连续艾灸10周。具体艾灸方法为：将艾绒做成1/4麦粒大小的小艾炷(呈圆锥形)，重量约5 mg/壮；剃除艾灸组大鼠穴区3 cm×2 cm(长×宽)的鼠毛，暴露穴位周围皮肤。待大鼠固定后，将小艾炷放置在大鼠两侧肝俞穴上点燃，艾炷燃灭后，更换艾炷再次施灸。大鼠肝俞穴的定位参照《实验针灸学》[7]的标准取穴。

2.2 取材与检测

造模完成后，所有大鼠尾静脉取1.5 mL血置于肝素抗凝管中，静置2 h后，离心15 min，转速为3 500 r/min。离心后取250 μL血清装入冻存管，放置于-80℃冰箱保存备用。根据每只大鼠的体重，按0.25 mL/100 g的剂量腹腔注射1.5%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，取出肝脏，切取肝脏组织并浸泡于甲醛溶液中，1周后进行脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、HE染色、封片，最后采用光学显微镜观察大鼠肝脏组织的病理变化。血清TNF-α、AFP的测定采用ELisa(酶联免疫吸附法)检测。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 各组大鼠造模后血清TNF-α、AFP含量的比较

造模结束后，与对照组相比，模型组血清TNF-α、AFP含量均明显升高(P<0.05)，差异有统计学意义。与模型组相比，艾灸1组血清TNF-α、AFP含量均明显血清(P<0.05)，差异有统计学意义。艾灸2组降低TNF-α、AFP含量均降低(P>0.05)，但无统计学意义；艾灸1组与艾灸2组相比，TNF-α、AFP含量无明显变化(均P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠造模后TNF-α、AFP的含量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；实验过程中大鼠有死亡，故样本数少于初始量。

3.2 各组大鼠肝组织病理学变化

对照组大鼠肝细胞胞浆胞核均匀,肝细胞索排列整齐，呈放射状，肝细胞形态正常；模型组细胞核深染，异型性增加，核/质比增大，小叶结构完全破坏，部分出现核固缩和核碎裂现象；艾灸1组存在少量肝板，核/质比略增大，肝细胞有双核，细胞核异型性低；艾灸2组，细胞核深染、核/质比增大，出现核固缩现象，肝细胞有双核。见封三彩图1。

4 讨论

从历代文献记载可以发现，灸法在防治肿瘤方面历史悠久。原发性肝癌在传统中医学属“癥瘕”“积聚”“臌胀”等范畴。《景岳全书·卷二十三》记载:“……但察其脉络所由者，皆当按其处而通灸之，火力所到，则其坚聚之气自然以渐解散”，不仅说明灸法能够散结化滞，而且说明艾灸达到有效的灸量才能产生最佳的效果。有研究表明[8],灸法在肝癌防治过程中的各个阶段都有积极的作用。背俞穴是脏腑之气汇聚之处，《灵枢·背腧第五十一》指出：“按其处，……乃其俞也。灸之则可，刺之则不可。气盛则泻之，虚则补之”,说明背俞穴可以采用灸法对所属脏腑补虚泻实。根据《素问》“治脏者治其俞，治腑者治其合”的中医治疗原则，取肝俞穴能够直接、快速、有效地激发肝脏的气血，调节脏腑阴阳。而且相关研究发现瘢痕灸肝俞穴对HCC的效果要优于足三里穴[9]。在多种肝癌模型中,DEN诱发肝癌癌前病变的阶段性特征与人类病程类似[10],故本实验采用DEN复制HCC模型，并在造模的同时采用不同灸量的小艾炷灸干预，从而观察不同艾灸肝俞穴对HCC模型大鼠癌前病变期血清中TNF-α、AFP及肝脏组织形态的影响。

TNF-α是一种具有促炎活性和免疫调节功能的炎症因子，在肿瘤微环境中的组成性表达是许多恶性肿瘤的共同特征。在肝癌的研究中发现，TNF-α可通过多种途径促进肝癌细胞的增殖及迁移，抑制肝癌细胞的凋亡。主要体现在以下几个途径：①TNF-α与其受体结合后，通过激活caspase级联反应通路、NF-κB信号等通路，促进细胞分裂，进一步加快肝癌细胞的增殖[11-14];②TNF-α在肿瘤微环境中诱导TNC的表达,进而促进了肝癌细胞的迁移[15];③TNF-α通过内质网应激信号通路诱导肝癌细胞自噬,从而促进肝癌细胞的增殖[16];④通过TNF-α/ROS/HIF-1途径明显上调肝癌细胞中 FoxM1的表达并增强其启动子的活性，从而促进肝癌细胞的增殖和抗凋亡[17];⑤TNF-α介导的线粒体解偶联作用可以促进肝癌细胞的迁移[18]。可以发现TNF-α是通过多种途径调控着肝癌细胞的增殖、凋亡与迁徙。

AFP来源于胚胎的干细胞,在临床上不仅是肝癌的经典肿瘤标记物，当作诊断肝癌的主要标准[19]，而且还可以结合活检、腹水等指标提高HCC恶性程度及预后的预测[20-21]。研究表明[22-23]：AFP是一种免疫抑制性蛋白质，具有免疫抑制作用，主要表现为促进肝癌细胞的生长, 并且AFP可以诱导肝癌患者T细胞和B细胞的自发应答， AFP疫苗可以作为肿瘤治疗的潜在工具。在本实验中，模型组大鼠血清TNF-α、AFP含量要明显高于对照组，而有直接灸干预的大鼠血清TNF-α、AFP含量要低于模型组，有降低趋势，说明直接灸能够降低HCC大鼠血清TNF-α、AFP的含量，直接灸在一定程度上能够抑制大鼠HCC细胞的增殖。结合光镜下肝脏组织切片HE染色的观察结果发现，直接灸组肝癌细胞的异型性、核固缩要少于模型组。

本实验结果表明：①直接灸肝俞穴能够对HCC模型大鼠癌前病变期TNF-α、AFP及肝脏组织形态有良性调节作用，在一定程度上能够抑制肝癌细胞的增殖；②两组直接灸中，艾灸1组的效果更好，但与艾灸2组比较，组间无差异，可能跟样本量的大小、艾灸干预的周期等有关，需进一步研究；③直接灸肝俞穴对HCC的作用机制可能与艾灸抑制肝细胞中TNF-α介导的相关信号通路有关。因此可以认为，直接灸能够适当抑制肝癌细胞的增殖，且灸量对肝癌细胞的影响存在差异。