一种通用循环免疫复合物抗体解离技术的建立及应用评价①

王 童 崔大伟 徐旭剑 孙长贵 戴玉柱 成 军

(蚌埠医学院研究生院，蚌埠233000)

病原微生物侵入机体或自身组织成分发生改变刺激机体免疫系统发生免疫应答，形成的免疫复合物(Immune complex,IC)可被机体的防御系统清除[1]，但在某些病理情况下，体内形成的IC不能被及时清除，引起一系列连锁反应而导致组织损伤[2,3]。因此，检查组织内或体液中循环免疫复合物(Circulating immune complexes,CICs)对某些疾病的诊断、病情观察、疗效判断、预后评估和发病机制研究等具有重要的临床病理价值和流行病学意义[4-6]。

目前，有关循环免疫复合物检测的方法主要有：(1)针对免疫复合物整体进行测定的抗原非特异性方法[7]以及抗原特异性方法[8]；(2)针对免疫复合物中抗原进行解离测定的抗原特异性方法[9-13]；(3)针对免疫复合物中抗体进行解离测定的抗体特异性方法[14]。然而，这些方法多数存在特异性差[7]、灵敏度不能满足临床诊疗[7,8,11,14]、适用范围窄[8-12,14]等不足，尤其是抗体特异性方法文献报道甚少且仅能用于特定免疫复合物中的抗体检测[14]。因此，我们在通用CIC抗原解离技术的基础上[13,15]，采用聚乙二醇(PEG)二次沉淀分离技术和Gly-HCl缓冲系统建立了一种通用CIC抗体解离技术，该技术可以对多种CICs中的抗体进行解离，然后采用相应的测定方法对CICs中的特异性抗体进行检测，本文以HBsAg免疫复合物(HBsAg-IC)为例建立CIC抗体解离技术，并进行应用评价。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本收集 153例HBV未感染者血清标本来自于健康体检人群(HBsAg,anti-HBs,HBeAg,anti-HBe,anti-HBc阴性)，作为模式1(HBV-M1)；455例HBV感染者血清标本，其中，HBsAg,HBeAg,anti-HBc阳性，即HBV-M2 108例；HBsAg,anti-HBe,anti-HBc阳性，即HBV-M3 165例；HBsAg,anti-HBc阳性，即HBV-M4 64例；anti-HBs,anti-HBe,anti-HBc阳性，即HBV-M5 118例；126例HCV感染者，32例HIV感染者，103例糖尿病患者，134例甲状腺功能亢进患者(应用评价组)，以及155例高血脂、高IgG、黄疸等其他疾病类型的血清标本(干扰对照组)来自于本院和浙江大学附属第一医院标本库。

1.1.2主要仪器与试剂 化学发光i2000免疫分析仪(美国Abbott 公司)， 3K18低温高速离心机(德国Sigma公司)，Imark 酶标仪及model 1575洗板机(美国Bio-Rad公司)，SHA-EA低温水浴摇床(常州精达公司)，osmomat 030冰点渗透压仪(德国Gonotec公司)，PP-50-P11精密pH计(德国Sartorius公司)。化学发光法测定HBV标志物、胰岛素(INS)、甲状腺球蛋白(TG)、抗-TG抗体试剂盒(美国Abbott公司)，ELISA检测HCV核心抗原、抗-HCV抗体、HIV 抗体试剂盒、HIV P24抗原试剂盒(美国Ortho公司)，免疫印迹法测定抗-INS抗体试剂盒(深圳伯劳特公司)。纯化HBsAg(3.0 mg/ml)、羊抗-HBsAg多克隆抗体(3.0 mg/ml)(杭州艾康公司)，纯化人TG(1 mg)、羊抗-TG多克隆抗体(1.5 mg/ml)、重组HIV 1 P24抗原(1 mg/ml)、重组INS(5 mg/ml)、羊抗-HCV core多克隆抗体(5 mg/ml)、重组HCV核心抗原(1 mg/ml)、羊抗-HIV 1 P24多克隆抗体(4 mg/ml)、羊抗-INS多克隆抗体(0.2 mg/ml)(英国Cambridge公司)。

1.2方法

1.2.1阳性对照 HBsAg-IC、HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC制备：在美国Abbott公司提供的化学发光测定HBsAg和anti-HBs试剂盒的线性范围内，按照合适的比例配制HBsAg-IC：用HBV标志物均阴性的献血员混合血清作为稀释剂，稀释羊抗-HBsAg多克隆抗体至500 mU/ml，然后加入纯化的人血HBsAg直至游离anti-HBs<15 mU/ml、游离HBsAg<1.5 U/ml为止，37℃2 h， 4℃过夜，即形成稳定的HBsAg-IC，精确计算anti-HBs终浓度为473.6 mU/ml，加0.02%proclin 300生物防腐剂后分装4℃保存备用，此为阳性对照；丙型肝炎核心抗原免疫复合物(HCV-IC)、人类缺陷免疫病毒P24抗原免疫复合物(HIV-IC)、胰岛素免疫复合物(INS-IC)、甲状腺球蛋白免疫复合物(TG-IC)制备参照HBsAg-IC方法。上述所有抗原、抗体测定和结果判断均按照相应试剂盒说明书进行操作。

1.2.2PEG二次沉淀分离法 分离剂A、分离剂B、溶解剂配制及二次沉淀分离方法参照文献操作[13,15]。

1.2.3HBsAg-IC中anti-HBs解离条件的确定

1.2.3.1解离剂配制 依据与CIC沉淀物混合后pH改变在-0.5～0.5之间时的最低Gly-HCl浓度配制 0.06 mol/L、pH(1.0,1.4,1.8,2.2)的等渗Gly-HCl缓冲系统作为CIC抗体解离剂，同时配制与不同pH CIC抗体解离剂等量混合后溶液pH为7.3～7.5且维持等渗状态的相应浓度Tris溶液为CIC抗体中和剂，用NaCl调节渗透压，并加入0.02%proclin 300作为防腐剂。

1.2.3.2实验设计 采用PEG二次沉淀分离法沉淀分离HBsAg-IC阳性对照[15]，然后在HBsAg-IC阳性对照分离沉淀物中分别加入0.06 mol/L、不同pH的CIC抗体解离剂，于不同温度(4℃,15℃,25℃,37℃)、解离时间(5、8、10、20 min)、解离振荡频率(0、20、60、100次/min)、解离后的放置时间(0、5、10、15 min)进行解离，按pH、温度、解离时间、解离振荡频率、放置时间，即五因素四水平正交设计实验，通过测定解离后的anti-HBs确定最佳解离条件。

1.2.3.3操作步骤 采用PEG二次沉淀分离法分离待测样本，HBsAg-CIC沉淀两份，分别用10 μl溶解剂溶解，一份同时加入70 μl 不同pH的CIC抗体解离剂和70 μl相应浓度的CIC抗体中和剂，混匀后测定anti-HBs，其结果作为空白值；另一份加入70 μl不同pH的CIC抗体解离剂，分别于不同温度、解离时间、振荡频率进行解离，然后加入70 μl相应浓度的CIC抗体中和剂，混匀后于不同放置时间测定anti-HBs，其结果作为测定值，每个实验重复3次取均值。为了保证HBsAg-IC中anti-HBs在解离、测定过程中的稳定性、可比性，CIC抗体解离剂及中和后的溶液均维持在等渗状态，测定anti-HBs时均用等体积、相应浓度的Tris作为“CIC抗体中和剂”恢复反应体系pH至7.3～7.5及维持等渗状态。

1.2.3.4结果判断 HBsAg-IC中anti-HBs结果判断标准见表1。

1.2.4方法学评价 参照文献[15]，采用HBsAg-IC阳性对照及收集的不同类型血清标本对CIC抗体解离技术的灵敏度、重复性、特异度、线性、干扰试验、解离率、回收率进行评价，同时对相关试剂的稳定性进行观察。

1.2.5HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC中抗体解离条件的确定 采用上述方法和步骤分别对HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC中的抗体解离条件进行实验研究，并测定定量项目的平均解离率。参照表1结果判断标准及相应抗体测定结果的Cutoff值判定样本中是否存在CICs。

1.2.6应用评价 采用本文建立的CIC抗体解离技术分别对608份HBV感染者和健康体检者血清标本中5种HBV模式的HBsAg-IC、126份HCV感染者的HCV-IC、32份HIV感染者的HIV-IC、103份糖尿病患者的INS-IC、134份甲状腺亢进患者的TG-IC血清标本进行分离、解离，然后采用相应的试剂盒测定解离后的相应抗体，并进行比较分析。

1.3统计学处理 正交设计实验、线性相关分析及抗体检出率比较由SPSS12.01软件完成，以P<0.05表示差异有统计学意义，散点图、直方图由GraphPad Prisma 5.0软件完成。

2 结果

2.1HBsAg-IC中anti-HBs解离条件 五因素四水平的正交设计实验分析结果，HBsAg-IC中anti-HBs的最佳解离条件为：CIC抗体解离剂pH1.80，15℃解离5～10 min，振荡频率>60次/min，加入CIC抗体中和剂后10 min内测定；CIC抗体解离剂选择含0.085 mol/L NaCl、 0.02%proclin 300生物防腐剂、pH1.80的0.06 mol/L Gly-HCl缓冲液，CIC抗体中和剂选择含0.138 mol/L NaCl、0.07 mol/L Tris、0.02%proclin 300生物防腐剂的水溶液。

表1解离测定CIC中抗体结果判断标准

Tab.1CriteriaforclassificationofantibodyafterCICsdissociation

Measurement valueBlank control valueExplanation>Cutoff*CutoffThis pattern did not exist or suggest random error>Cutoff>CutoffIf the measurement value was higher than the blank control value, there were CICs in the sample, and their concentration was determined on the basis of the difference.If the meas-urement value was lower than the blank control value, there were no CICs in the sample

Note：*.The cutoff value was obtained from the manufacturer′s instructions of each specific kit.

表3不同免疫复合物的抗体解离、测定条件及解离率

Tab.3Antibodydissociation,determinationconditionsanddissociationrateindifferentimmunecomplexeswithCICantibodydissociationtechnique

CICsConditions for dissociationRequirements for determinationMean dissociation rate (%)HCV-ICpH1.80, 15℃, 5-10 min, oscillation frequency>60 times/minAntibody measurement within 10 min after dissociation-*HIV-IC-*INS-IC-*TG-IC42.1%

Note：*.Qualitative test.

表2CIC抗体解离技术解离HBsAg-IC中anti-HBs的方法学评价结果

Tab.2Methodologicalevaluationofanti-HBsdissociationinHBsAg-ICwithCICantibodydissociationtechnique

MethodologicalparametersResultAnalytical sensitivityChemiluminescence>10 mU/mlReproducibility (CV)High concentration (original)4.38%Intermediate concentration (1∶1)5.31%Low concentration (1∶5)5.97%Assay specificityInterfere control (n=155) 100%Negative control (n=153)100%Dilution linearityRegression equationY=0.64X-0.18Y: actual anti-HBs in CICsX: theoretical anti-HBs Correlation coefficient(r)0.993 2Interference testExtent of interfering0.84% (-1.25%-2.17%)RecoveryRecovery rate95.4% (88.3%-99.5%)Dissociation rateDissociation rate64.3% (56.1%-68.0%)StabilityPrepared HBsAg-IC (positive control)4℃ for>24 monthsCIC separating agent (A,B)25℃ for>24 monthsCIC dissolving agent25℃ for>24 monthsCIC antibody dissociation agent4℃ for 12 monthsCIC antibody neutralizing agent4℃ for>24 months

2.2方法学评价 CIC抗体解离技术解离HBsAg-IC中anti-HBs的方法学评价结果见表2。

2.3HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC中抗体解离条件 HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC的解离条件、操作步骤和试剂组成与HBsAg-IC相同，但定量测定TG-IC中抗体的平均解离率与HBsAg-IC的抗体解离率不相同，结果见表3。

图1 CIC抗体解离技术解离HBsAg-IC、HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC中的抗体水平散点图和检出率直方图Fig.1 Scatter plot of antibody level and histogram of antibody detection rate in HBsAg-IC,HCV-IC,HIV-IC,INS-IC,TG-IC with CIC antibody dissociation technique

2.4应用评价 采用CIC抗体解离技术对608份HBV感染者和健康体检者5种HBV模式的血清HBSAg-IC进行分离、解离，然后测定HBSAg-IC中的anti-HBs，结果显示：不同HBV-M模式之间HBSAg-IC中的anti-HBs含量和检出率差异具有统计学意义(P<0.05)，以HBV-M2的HBsAg-IC中的anti-HBs含量[(65.68±67.86)mU/ml]和检出率(79.63%)最高，HBV-M1的HBsAg-IC中的anti-HBs含量[(0.08±0.04)mU/ml]和检出率(0%)最低(P<0.05)(图1A、B)；对126份HCV感染者的HCV-IC、32份HIV感染者的HIV-IC、103份糖尿病患者的INS-IC、134份甲状腺亢进患者的TG-IC血清标本进行分离、解离后分别测定相应抗体，其CIC中的抗体检出率分别为34.8%、66.7%、20.0%、14.3%(图1C)。

3 讨论

CIC抗体解离技术是一种能够对CICs进行沉淀、分离、解离后可直接定量测定特异性抗体的前处理技术。本研究采用了高渗的PEG二次沉淀分离法[13,15]将CIC从样本中高效分离出来，然后通过优化的CIC抗体解离技术将CIC中抗体最大程度地解离成游离抗体，最后采用临床实验室常规方法进行直接测定。超滤、超速离心、免疫磁珠及传统PEG沉淀法是分离CIC和病毒粒子的四种主要方法[7,16-18]，其中传统PEG沉淀法易于在实验室常规开展，故本实验采用PEG沉淀分离法。为了排除生物样本中其他杂蛋白的干扰，本研究采用了多试剂分步骤的方式来分离、解离生物样本CIC中的抗原和抗体，通过加入适量NaCl提高渗透压(500～530 osm)的二次沉淀分离法提高了CIC的分离沉淀效率、大大减少其他大分子杂蛋白的共沉淀及游离抗原的吸附对测定结果的干扰[15]。在解离、测定过程中，采用缓冲系统和等渗的措施避免了各种参与反应的试剂成分对CIC中抗体的损伤和破坏，这些影响因素以往一直未受到重视和关注[7,9-12]，有效地保证了测定结果的重复性、可靠性和有效性。该技术既适用于游离抗体阴性的标本，又适用于游离抗体阳性甚至高浓度的标本，并且还可以对标本中低水平CICs进行浓缩分离、解离，达到提高检出率的目的。

采用本文建立的CIC抗体解技术分别对HBsAg-IC、HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC进行应用评价：HBV-M1模式为未感染HBV的健康体检人群，因血清中不存在HBV标志物，也不存在HBsAg-IC，因此HBsAg-IC中的anti-HBs结果均为阴性，该试验说明了CIC抗体解离技术的特异性良好；HBV-M2、HBV-M3、HBV-M4均为HBV感染模式(游离HBsAg阳性)，HBV-M5为HBV恢复期或既往感染模式(游离HBsAg阴性)，四种HBV血清标志物模式均检出anti-HBs，以HBV-M2最高，与实际相符。本技术在HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC中的检测应用也得到了较为满意的结果，对于部分标本CIC中抗体未检测到，分析可能有以下3个方面的原因：①患者血清标本中不存在CIC；②患者血清标本中存在低水平CIC，目前的沉淀分离技术和测定方法还达不到灵敏度要求；③其他尚未发现的原因。这些结果可能间接反映了患者可能存在不同的临床表现、病理特点和疾病进展或慢性化的特征，将在今后的系列研究中报道。

由于本文主要对多种抗原形成免疫复合物中的多克隆抗体进行分离、解离和测定，因此这些抗体的解离条件基本相同，对于参与形成免疫复合物的单克隆抗体及抗体的种类(如IgG,IgM,IgA)在沉淀分离、解离过程有何影响？未作更详细的实验比较，还有待今后的进一步研究探讨。

综上所述，本文建立的CIC抗体解离技术，有以下几个创新点或优点：①采用高渗的PEG二次沉淀分离法，提高了样本中CICs的分离效率，同时也有效降低了随CIC共沉淀的游离抗原、抗体等干扰物浓度对CIC中抗体测定的干扰；②在解离、中和、测定过程中，始终保持CIC和所解离的抗体处于等渗环境，最大程度地减少待测抗体不受损伤，从而保证了测定结果的稳定；③提出采用解离率来评价解离技术的性能更客观、更科学；④该技术可以对标本中低水平CICs进行浓缩分离、解离，对于感染性疾病窗口期和游离抗体阴性的标本，提高了CIC中抗体的检出阳性率，即诊断灵敏度；⑤该技术适合在临床免疫学实验室常规开展，对CIC中抗体进行定量测定有助于临床医生对疾病的进展、预后做出量化评估。