高效液相色谱-切换波长法同时测定左金丸中盐酸小檗碱及吴茱萸碱含量

敖华蓉，龚春燕

（湖北省宜昌市第二人民医院，湖北 宜昌 443000）

左金丸源自元代朱丹溪《丹溪心法·火六》[1]，由黄连和吴茱萸组方，两者配伍，有泻火疏肝、和胃止痛功效，可用于肝火犯胃而见吞酸、胃痛之证[2]，临床多用于肝火犯胃型急慢性胃炎[3]、反流性食管炎[4]、慢性糜烂性胃炎[5]、腹泻型肠易激综合征[6]、胆汁反流性胃炎[7]等胃肠道疾病的治疗。黄连 Coptis chinensis Franch．为毛茛科植物黄连的干燥根茎，具有清热燥湿、泻火解毒功效，主要成分为盐酸小檗碱[2，8]。吴茱萸 Euodia rutaecarpa(Juss．)Benth．为芸香科植物吴茱萸的干燥近成熟果实，具有散寒止痛、降逆止呕功效，主要成分为吴茱萸碱[2，9]。现有报道多集中于单一成分的研究，或将两者在同一波长下测定。对此，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）-切换波长法同时测定左金丸中盐酸小檗碱、吴茱萸碱含量，为其质量控制提供理论依据。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Agilent 1260型HPLC仪，包括Agilent Chem化学工作站、G4212B型DAD双波长切换检测器（美国Agilent公司）；Ultimate AQ C18色谱柱(月旭科技 ＜上海＞股份有限公司)；AG135型电子分析天平（瑞士 Mettler-Toledo公司）；BP121S型电子分析天平（德国 Sartorius公司）；KQ-300ES型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1．2 试药

盐酸小檗碱对照品（批号为 110713-200609）、吴茱萸碱对照品（批号为110802-200606)，供含量测定用，均购自中国食品药品检定研究院；左金丸（厦门中药厂有限公司，国药准字Z35020033，批号分别为20160406，20160510，20161812，规格为每 12 丸约 1 g）；乙腈、十二烷基硫酸钠溶液、磷酸、甲醇均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：Ultimate AQ C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-1．5 mmol／L 十二烷基硫酸钠溶液（以磷酸调 pH 至 5．0，B），梯度洗脱（洗脱程序见表 1）；检测波长：盐酸小檗碱为265 nm、吴茱萸碱为225 nm；流速：1 mL ／min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2．2 溶液制备

称取盐酸小檗碱、吴茱萸碱对照品各适量，精密称定，加甲醇制成两者质量浓度分别为 450 μg／mL和560 μg／mL的溶液，即得混合对照品溶液。称取样品适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL，称定质量，超声（功率为250W，频率为40kHz）处理45min，放至室温，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，得溶液1；精密吸取该溶液10 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，经 0．45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按左金丸处方制备缺黄连、吴茱萸药材的阴性对照样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

系统适用性试验：取2．2项下混合对照品溶液、阴性对照品溶液适量，按2．1项下色谱条件分别在波长为265 nm和225 nm时进样测定，记录色谱图，见图1。理论板数以盐酸小檗碱峰计应不小于3 000，以吴茱萸碱峰计应不小于4 000，分离度均大于1．5。

专属性试验：取2．2项下供试品溶液、阴性对照品溶液适量，按2．1项下色谱条件分别在波长为265 nm和225 nm时进样测定，记录色谱图，见图1。在265 nm波长处盐酸小檗碱阴性对照无干扰，在225 nm波长处吴茱萸碱阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。

耐用性试验：依法制备供试品溶液，分别改变色谱柱品牌及型号、柱温、流速，按2．1项下色谱条件进样测定。结果见表2。可见，在一定条件下，改变色谱柱品牌及型号、柱温、流速，不影响样品含量测定。

图1 高效液相色谱

表2 耐用性试验结果

线性关系考察：分别各称取盐酸小檗碱、吴茱萸碱对照品适量，精密称定，以甲醇溶解，制成盐酸小檗碱质量浓度分别为 0，2．25，4．50，22．50，112．50 μg ／mL，吴 茱 萸 碱 质 量 浓 度 分 别 为 0，2．80，5．60，28．00，140．00 μg／mL 的系列单一对照品溶液。按 2．1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标、对照品溶液质量浓度（X，μg／mL）为横坐标绘制标准曲线，得盐酸小檗碱、吴茱萸碱回归方程分别为Y＝27 409X-1 063，r＝0．999 6（n＝5）；Y′＝18 075X′-1 326，r＝0．999 3（n＝5）。盐酸小檗碱、吴茱萸碱质量浓度线性范围分别为 2．25～112．50 μg／mL 和 2．8～140．0 μg ／mL。

精密度试验：精密量取混合对照品溶液适量，共6份，按2．1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果盐酸小檗碱、吴茱萸碱峰面积的 RSD分别为 1．15%，1．39%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取供试品溶液（批号为20160510）适量，分别于室温下放置 0，2，4，12，24，36 h时按2．1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果盐酸小檗碱、吴茱萸碱峰面积的 RSD为1．43%和1．26%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置36 h内稳定。

重复性试验：取样品（批号为20160510）适量，依法制备供试品溶液，按2．1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果盐酸小檗碱、吴茱萸碱峰面积的 RSD为1．07% 和 1．54%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取样品（批号为20160510）适量，共12份，分别精密加入一定量的盐酸小檗碱、吴茱萸碱对照品溶液（各6份），依法制备供试品溶液，按2．1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果见表3。

2．4 样品含量测定

分别称取不同批号的样品适量，依法制备供试品溶液，按 2．1项下色谱条件进样 10 μL，测定样品中盐酸小檗碱和吴茱萸碱的峰面积，按外标法计算含量。结果见表4。

表3 加样回收试验结果(n＝6)

表 4 样品含量测定结果（mg／g，n＝3）

3 讨论

3．1 流动相选择

预试验中，参考文献[10-11]，考察了乙腈（A）-1．5 mmol／L 十二烷基硫酸钠溶液、乙腈（A）-1．5 mmol／L十二烷基硫酸钠溶液（以磷酸调 pH至5．0）- 水（含 0．05% 甲酸）- 乙腈（B）、乙腈 -0．04% 磷酸溶液为流动相时，盐酸小檗碱、吴茱萸碱色谱峰的出峰情况。结果表明，当流动相为乙腈（A）-1．5 mmol／L十二烷基硫酸钠溶液（以磷酸调pH至 5．0）时，上述2种成分峰形完整、清晰可辨。

3．2 检测波长选择

预试验中采用全波长扫描法，将供试品溶液置0～400 nm波长范围内扫描，结果在265 nm和225 nm波长时，盐酸小檗碱、吴茱萸碱均有色谱峰出现，但265 nm波长处吴茱萸碱峰形杂乱、不明显，而盐酸小檗碱峰形尖锐，图形对称，保留时间适中；225 nm波长处盐酸小檗碱峰形易受其他物质干扰，而吴茱萸碱则峰形完整、清晰，周围无杂峰。因此选择双波长测定上述2种成分，保证了试验结果的准确可靠。

3．3 pH 选择

用反相离子对色谱法分析碱性成分时，碱性成分的色谱行为会随流动相pH的变化而有较大改变[12]。预试验中考察了不同 pH（3．5，5．0，6．5）对盐酸小檗碱、吴茱萸碱色谱行为的影响。结果表明，当pH较低时（pH≤3．5），各色谱峰出峰时间过长，其原因可能与离子对的稳定常数有关；当pH较高时（pH≥6．5），上述2种成分色谱峰未能达到完全基线分离，部分色谱峰峰形对称性差；当pH为5．0时，各色谱峰分离效果较好，峰形尖锐、对称性好，保留时间适中，有利于供试品溶液的分析测定。因此以磷酸调流动相pH至5．0。

3．4 洗脱条件选择

预试验中考察了等度洗脱和不同比例的梯度洗脱，最终确定，在上述梯度洗脱程序下，40 min内可检出供试品溶液中的盐酸小檗碱及吴茱萸碱。

综上所述，本研究中建立的HPLC-切换波长法简便、灵敏、准确、重复性好，可为制订左金丸的质量标准提供理论依据。