高效液相色谱法测定余甘子提取物中没食子酸与鞣花酸含量

张文莉 ，张俊仪 ，张龙开，黄月纯，林伟斌，梁芷韵 ，魏 刚

（1．无限极 ＜中国 ＞有限公司，广东 江门 529156； 2．广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州510006； 3．广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405； 4．广州中医药大学，广东 广州 510006）

余甘子为大戟科植物余甘子 Phyllanthusemblica L．的干燥成熟果实，有清热凉血、消食健胃、生津止渴功效，常用于治疗血热血瘀、消化不良、腹胀、咳嗽、喉咙痛及口干[1]。余甘子富含酚类、维生素、氨基酸、黄酮等生物活性物质[2]，主要有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗病毒[5]、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化[6]、免疫调节等[7]药理作用。近几年的研究主要集中在药物效应学与食品和保健品开发[8]。目前，余甘子药材的质量控制方法主要有2015年版《中国药典（一部）》收载的高效液相色谱（HPLC）法[1]。研究表明，余甘子药材的质量与其来源、产地的地理环境、气候、土壤等生长条件及采收加工方法关系较大[9-10]，提示药典仅通过检测没食子酸含量控制余甘子质量专属性不强。除没食子酸外，余甘子尚含较多的鞣花酸、柯里拉京等多种酚酸类成分，采用特征指纹图谱进行分析能更好地对余甘子进行质量评价[11-13]。余甘子提取物是由余甘子提取加工而成，常用作于药品、保健品的原料。本研究中参考药典余甘子标准检测方法及文献记载方法，对余甘子提取物中没食子酸和鞣花酸含量进行测定，为评价其质量提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100型HPLC仪（包括二极管阵列检测器，美国Agilent公司）；KQ-400 KDE型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。10批余甘子提取物（编号S1～S10，来源见表1）；余甘子药材，经广州中医药大学魏刚研究员鉴定为大戟科植物余甘子 Phyllanthus emblical．的干燥成熟果实；没食子酸对照品（批号为110831-201605，纯度为 89．9% ），鞣花酸对照品（批号为111959-201602，纯度为 89．3%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（Merck公司，色谱纯），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 没食子酸含量测定

2．1．1 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB Aq 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0．2%磷酸溶液 （B）系统，梯度洗脱，0～10 min，A 为 2% →10% ，10～15 min，A 为 10% →20% ，15～20 min，A 为 20% →30% ，20～25 min，A 为30%→40%，25～35 min，A 为 40%→60%，35～40 min，A为60%→90%；检测波长：273 nm；柱温：30℃；流速：1．0 mL ／min；进样量为 10 μL。

表1 余甘子提取物样品来源

2．1．2 溶液制备

取样品粉末0．2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超声(功率为320 W，频率为40 kHz)提取60 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取没食子酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含0．282 mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。

2．1．3 方法学考察

专属性试验：取 2．1．2 项下 2 种溶液，按 2．1．1 项下色谱条件进样测定。结果色谱峰分离度良好，峰形尖锐，符合含量测定要求(见图1 A和图1 B)。

线性关系考察：分别精密吸取2．1．2项下对照品溶液 1，2，5，10，15 μL，进样分析，测定峰面积。以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝2 914．6 X-15．21，r＝0．999 9（n＝5）。结果表明，没食子酸进样量在 0．282～4．230 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

图1 专属性试验高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果的 RSD为0．03%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品（S1）溶液10 μL，分别在室温下放置 0，2，4，8，12，24 h 时进样，测定峰面积。结果的 RSD为 0．11%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

重复性试验：分别精密称取同一批样品（S2）6份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果平均含量为37．15 mg／g，RSD 为 0．68% （n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取6份已知含量的样品（S2，含水分 3．15% ，按干燥品计算含量为 38．36 mg ／g），每份约0．1 g，精密称定。然后分别精密加入一定量的对照品，依法制备供试品溶液，按2．1．1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。

2．2 鞣花酸含量测定

2．2．1 色谱条件

色谱柱：ZorbaxSB Aq 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0．2% 磷酸溶液（B）系统，梯度洗脱，0～10 min时A为40%→60%，10～15 min时A为60%→90%，15～20 min时A为90%；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；流速：1．0 mL ／min；进样量 10 μL。

2．2．2 溶液制备

取样品粉末0．2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声提取60 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取鞣花酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含鞣花酸0．043 6 μg 的溶液，摇匀，即得对照品溶液。

2．2．3 方法学考察

专属性试验：取 2．2．2 项下 2 种溶液，按 2．2．1 项下色谱条件进样测定。结果色谱峰分离度良好，峰形尖锐，符合含量测定要求(见图1A′和图1B′)。

线性关系考察：分别精密吸取2．2．2项下对照品溶液 1，2，5，10，15 μL，进样分析，测定峰面积。以进样量（X，μg）为横坐标、色谱峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝9 054．5 X-9．077，r＝0．999 9（n＝5）。结果表明，鞣花酸进样量在 0．043 6～0．654 0 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果的 RSD为0．26%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品（S1）溶液10 μL，分别在室温下放置 0，2，4，8，12，24 h 时测定峰面积。结果的 RSD为0．38%（n＝6），表明供试品溶液室温下放置24 h内稳定。

重复性试验：分别精密称取同一批样品（S2）6份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果平均含量为13．52 mg／g，RSD 为 0．43% （n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取6份已知含量的样品（S2，含水分 3．15% ，按干燥品计算含量为 13．52 mg ／g），每份约为0．1 g，精密称定，然后分别精密加入一定量的对照品，依法制备供试品溶液，按2．2．1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表3。

表2 没食子酸加样回收试验结果（n＝6）

表3 鞣花酸加样回收试验结果（n＝6）

2．3 样品含量测定

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5～10 μL，按拟订色谱条件进样分析，外标法测定含量。结果见表4。

表4 余甘子提取物含量测定结果（n＝2）

3 讨论

2015年版《中国药典（一部）》余甘子药材质量标准中，采用HPLC法测定没食子酸含量时的检测波长为273 nm，本研究中以此测定余甘子中没食子酸含量。而测定余甘子中鞣花酸含量的检测波长254 nm是参考文献确定的。

由于其酚酸类成分极性差异大，不同溶剂对没食子酸、鞣花酸提取效果差异较大。本试验中分别以不同体积分数甲醇为溶剂考察对没食子酸和鞣花酸提取效果的影响，结果显示，50%甲醇对没食子酸提取效果明显优于其他体积分数甲醇。而鞣花酸以甲醇为溶剂时提取率较高。本研究中参考2015年版《中国药典（一部）》[1]及文献[3]，拟订分别以50%甲醇和甲醇为溶剂制备供试品溶液测定2种成分的含量。同时对2种成分的超声时间（45，60，75 min）及取样量（0．1，0．2，0．3 g）进行了优化筛选。结果显示，提取时间和取样量的改变对没食子酸、鞣花酸的提取率均无明显影响，故确定采用将提取物粉末0．2 g加入相应溶剂50 mL超声提取60 min的方法制备供试品溶液。

没食子酸和鞣花酸极性差异较大，采用梯度洗脱可同时测定其含量[3]，因所用溶剂不同，故对鞣花酸测定的流动相梯度进行了优化调整，缩短了保留时间。加样回收试验等方法学验证表明，所建立的方法简便可行。

根据含量测定结果判定，10批样品中有2批为未知伪品，其没食子酸与鞣花酸含量均为0。8批正品含量差异较大，没食子酸含量为 12．79～105．07 mg／g，鞣花酸含量为 3．09～33．47 mg／g，最高与最低含量的差分别达8倍和10倍，提示市场上余甘子提取物质量差异较大。由于没食子酸的专属性相对较差，而药典余甘子标准仅以没食子酸含量作为定量指标，提示药典余甘子质量控制指标专属性不强。本试验中所采用的没食子酸结合鞣花酸含量测定方法，能更好地控制余甘子提取物的质量。

文献对余甘子提取物的伪品报道较少，检出的2批伪品暂未能确定其来源。但即使是正品，不同厂家产品含量差异也比较大，主要可能与药材来源、制备工艺等相关。因此，应加强原料质量控制，规范稳定的制备工艺，才能更好地保障提取物质量的稳定性。