HPLC法同时测定小儿退热口服液中四种目标成分

冯叶彬

小儿退热口服液主要由大青叶、板蓝根、金银花、栀子、牡丹皮、黄芩、连翘、淡竹叶等十二味中药组成[1]，具有疏风解表、解毒利咽的功效，用于小儿外感风热所致的感冒[2]。其中金银花的主要药效活性成分为绿原酸，栀子的主要药效活性成分为栀子苷，牡丹皮的主要药效活性成分为丹皮酚，黄芩的主要药效活性成分为黄芩苷[3-6]。2015版《中国药典》分别对栀子苷和黄芩苷进行含量测定[7]，而对绿原酸和丹皮酚仅进行了薄层鉴别，对于小儿退热口服液的质量控制方法有待进一步提高。目前有报道分别测定不同制剂中绿原酸、丹皮酚、黄芩苷、栀子苷的含量[8-11]，但能够同时对这4种成分进行测定的报道较少，为进一步提高药品有效成分含量的稳定度，提高药品质量，本文通过HPLC梯度洗脱体系，同时测定样品中绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚的含量，建立了小儿退热口服液中四种目标成分含量测定的HPLC方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪；Milli-QA超纯水器（Millipore），METTLER TOLEDO XS205分析天平。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号：110753-201314）（中国药品生物制品检定所）、栀子苷对照品（批号：110749-200512）（中国药品生物制品检定所）、黄芩苷对照品（批号：110725-201321）（中国药品生物制品检定所）、丹皮酚对照品（批号：110708-200506）（中国药品生物制品检定所），甲醇为色谱纯（默克公司），蒸馏水，其余使用试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。小儿退热口服液（批号：14263934、15260262、14263933，厂家：北京同仁堂科技发展股份有限公司）。

2 方法

2.1 含量测定

色谱条件：色谱柱为Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱（洗脱梯度见表1）；检测波长：绿原酸为330 nm，栀子苷为240 nm，黄芩苷、丹皮酚为278 nm；流速：1 ml/min；柱温：30℃；进样量：10 μl；理论板数按丹皮酚峰计算应不低于5 000，详见表1。

2.2 对照品溶液制备

分别取绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚对照品适量，进行精密称定，用50%甲醇溶解，最后制备成每毫升含绿原酸10 μg、栀子苷50 μg、黄芩苷50 μg、丹皮酚10 μg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

用移液管精密量取小儿退热口服液供试品1 ml，倒入25 ml容量瓶，用50%甲醇逐步适量稀释定容至所需刻度，充分摇匀，缓慢滤过，取续滤液，即得小儿退热口服液供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液制备

根据小儿退热口服液处方的比例制备缺乏绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚的阴性样品，将阴性样品按照“2.3”项下的制备方法配置成阴性样品溶液。

2.5 标准曲线制备

分别精密量取绿原酸（0.034 58 mg/ml）、栀子苷（0.243 12 mg/ml）、黄芩苷（0.339 67 mg/ml）、丹皮酚（0.050 36 mg/ml）的对照品储备液 0.1、0.2、0.5、1、2、5 ml，置于10 ml量瓶中，用50%甲醇逐步稀释至所需刻度，充分摇匀，分别精密吸取10 μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚峰面积，以对照品峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。

表1 洗脱梯度

表 2 回归方程与线性范围

图1 小儿退热口服液含量测定高效液相色谱图

3 结果

3.1 专属性试验

分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定；图1结果显示：供试品中绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚色谱峰与其他杂质峰达到基线分离，表明阴性样品溶液无干扰。

3.2 线性关系考察

按照方法项下2.5操作，线性范围与回归方程见表2。

3.3 精密度试验

同一对照品溶液精密吸取10 μl，连续重复进样6次，结果显示绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚峰面积的RSD分别为0.43%、0.20%、0.42%和0.10%，表明本法精密度良好。

3.4 稳定性试验

分别量取已制备的小儿退热口服液供试品溶液，室温放置，并于第0、2、4、8、12、24 h进样来测定峰面积，结果显示绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚RSD分别为0.10%、0.69%、0.55%、1.24%，表明小儿退热口服液供试品溶液在24 h内非常稳定。

3.5 重现性试验

分别量取6份同一批样品（批号：15260262，厂家：北京同仁堂科技发展股份有限公司），严格按照含量测定下方法对样品进行平行测定，结果为：绿原酸含量为0.355 0 mg/ml（RSD=0.52%），栀子苷含量为1.811 5mg/ml（RSD=1.12%），黄芩苷含量为1.851 6 mg/ml（RSD=1.49%），丹皮酚含量为0.157 8 mg/ml（RSD=0.49%），表明该方法测量样品的重现性良好。

3.6 回收率试验

用量筒精密量取已知含量的样品0.5 ml（批号：15260262，厂家：北京同仁堂科技发展股份有限公司），共取6份，分别精密加入对照品溶液（绿原酸0.176 3 mg/ml、栀子苷0.911 15 mg/ml、黄芩苷0.916 7 mg/ml、丹皮酚0.072 4 mg/ml）1 ml，按照制备供试品溶液的方法进行制备，平行测定，计算回收率。结果见表3。

表3 回收率试验结果（n=6）

3.7 样品含量

量取“2.3”项下3个批号的小儿退热口服液供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件分别进行测定，并记录峰面积，按外标法计算各批次样品中绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚的含量。测定结果：批号为14263934、15260262、14263933的3批样品中绿原酸含量分别为0.205 8 mg/ml、0.355 0 mg/ml、0.214 2 mg/ml，栀子苷含量分别为1.568 9 mg/ml、1.811 5 mg/ml、1.602 6 mg/ml，黄芩苷含量分别为2.158 6 mg/ml、1.851 6 mg/ml、2.178 0 mg/ml，丹皮酚含量分别为0.258 0 mg/ml、0.157 8 mg/ml、0.258 0 mg/ml。

4 讨论

4.1 色谱条件的选择

丹皮酚和栀子苷一般采用甲醇-水体系进行分离系统，黄芩苷与绿原酸一般采用甲醇-磷酸缓冲盐体系进行分离。实验发现绿源酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚四种成分在甲醇-磷酸盐缓冲体系中均峰形良好。通过考察不同比例磷酸（0.1%、0.2%、0.3%，0.4%），发现浓度为0.2%时峰形对称，理论塔板数较好。由于小儿退热口服液处方药味较多，成分比较复杂，黄芩苷与丹皮酚峰比较接近，较难分离，故采用梯度洗脱方法[12-13]。

4.2 检测波长的确定

采用Agilent工作站的DAD检测器来进行全波长扫描，发现绿原酸在330 nm，栀子苷在240 nm，黄芩苷和丹皮酚在278 nm波长处有最大吸收。故选择330 nm测定绿原酸，240 nm测定栀子苷，278 nm测定丹皮酚。

4.3 供试品制备

由于小儿退热口服液已经经过水提和醇提过程，且目标成分均为水溶性成分，只需要简单的稀释即可进行测定。实验证明此方法简单可靠，操作性高。

本实验结果表明本文建立的HPLC方法简单、准确、灵敏，重现性好，适用于小儿退热口服液的质量控制。