止泻木子中锥丝碱的提取工艺△

2019-01-16郑光杰邱娜刘凡凡晋敦青孙博航

中国现代中药 2018年12期

郑光杰，邱娜，刘凡凡，晋敦青，孙博航*

(1.沈阳药科大学中药学院/基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室，辽宁沈阳 110016；2.郑州市中心医院药学部，河南郑州 467000)

止泻木子为夹竹桃科止泻木属止泻木的干燥种子，其主要产于我国西藏、新疆、青海、广西等高海拔地区以及印度、尼泊尔等南亚国家与地区[1]。止泻木子具有较大的药用价值，民族医药中主要用其治疗赤巴病、腹泻、痢疾等疾病[2-3]。近年来研究表明，止泻木子中的甾体生物碱是其主要生物活性成分[4]，在这些生物碱中锥丝碱的含量较大[1]，且进一步研究发现，锥丝碱具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，在杀灭寄生虫、抗菌等作用方面也具有较好的药理活性[4-9]。但是关于止泻木子活性部位提取工艺和质量控制研究方面尚未见到相关报道，因此本课题以止泻木子为研究对象，以锥丝碱为指标性成分，采用响应曲面法优化止泻木子中锥丝碱的提取工艺[10-11]，为进一步研究其质量控制方法、开发利用止泻木子的药用经济价值具有重要的意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AB135-S 型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；HH-S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)；UV-1700型紫外分光光度计[岛津国际贸易(上海)有限公司]；R-1001N 型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)；LC-NetⅡ/ADC高效液相色谱分析仪(日本分光株式会社)；DZTW调温电热套(北京市永光明医疗仪器厂)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；分析色谱柱YMC-Pack ODS-A(日本YMC公司)。

1.2 试药

锥丝碱对照品(自制，HPLC测定含量≥98%)；甲醇(色谱纯，山东禹王化工有限公司)；超纯水；其他试剂均为分析纯。

干燥的止泻木子2015年7月购于安国市新辉药业有限公司，产地新疆，经沈阳药科大学路金才教授鉴定为止泻木子，药材留样保存于本研究室。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

精密称取干燥的止泻木子粉末4.5 g至圆底烧瓶中，按照实验设计要求进行加热回流提取，趁热抽滤得滤液，合并滤液，减压浓缩，将浓缩液用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，摇匀，制成供试品溶液，备用。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取锥丝碱对照品4 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即制成质量浓度为0.4 mg·mL-1的锥丝碱对照品溶液。

2.3 色谱条件

流动相95%甲醇(含二乙胺2‰)，检测波长215 nm，柱温25 ℃，流速0.8 mL·min-1，进样量10 μL，供试品、对照品HPLC图见图1。

2.4 标准曲线的制定

精密配制锥丝碱储备液(质量浓度为1.01 mg·mL-1)，分别精密量取该储备液1、2、4、6、8 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀释到刻度，摇匀，分别进样。以色谱峰峰面积(Y)与对照品溶液浓度(X)进行线性回归分析，得线性回归方程Y=6 780 324.63X+8 404.85，r=0.999 9。结果表明，锥丝碱在0.101～0.808 mg·mL-1色谱峰峰面积与对照品浓度线性关系良好。

注：A.锥丝碱对照品；B.供试品。图1 锥丝碱对照品、供试品液相色谱图

2.5 单因素试验

分别选取提取时间、甲醇浓度、料液比作为影响止泻木子中锥丝碱提取工艺的3个因素，进行单因素试验，结果表明，提取时间在0.5～2.5 h、甲醇浓度60%～100%、料液比1∶6～1∶14存在极值。

2.6 提取条件的响应面法优化分析

通过响应曲面法对影响锥丝碱提取效果较大的3个因素提取时间、甲醇浓度、料液比进行优化，以锥丝碱含量为响应值，设计了三因素三水平的试验方案。通过单因素试验确定了3个因素的取值范围。

采用Box-Behnken Design(BBD)设计三因素三水平共17组试验，以锥丝碱的含量(Y)为响应值，经回归拟合后，各因素与响应值的回归方程为Y=2.61+0.12A-0.030B+62.5-0.03C-0.043AB+0.020AC-0.022BC-0.19A2+0.076B2-0.034C2。实验设计及结果见表1～2。

由方差分析可知，该回归模型P<0.000 1，表明回归方程模型极其显著；失拟项P=0.160 0>0.05，表明失拟不显著，从而说明该模型能够对止泻木子中锥丝碱的提取率进行准确的预测和分析。从回归方程系数显著性检验可知：一项式A、B极其显著；二项式A2、B2极其显著；交互项AB具有一定的显著性，AC和BC不显著。说明不同的提取工艺对止泻木子中锥丝碱提取率并非简单的线性关系。

表1 止泻木子中锥丝碱提取工艺BBD设计因素

对拟合方程求解，得最优提取参数：甲醇浓度73.14%；提取时间70.63 min；液料比1∶8.63，预测止泻木子中锥丝碱的质量分数为2.638 72 mg·g-1。考虑到实验的可操作性，将工艺优化为料液比1∶9，提取时间为70 min，甲醇浓度为75%。

根据所拟合的回归方程，作相应曲面图，考察所拟合的响应曲面形状，分析甲醇浓度、料液比、提取时间对止泻木子中锥丝碱提取率的影响。其等高线图和3D响应曲面图见图2～4。3组图直观地反应了各因素对响应值的相互影响，甲醇浓度和提取时间的相互作用较显著。等高线的形状可反应出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则表明因素间交互作用较弱。