胡杨树脂提取物抗炎活性筛选及化学成分分析△

龚雪，李柱，张娜，王杰，韩奇亨，任凯，张春红，3，4*，李旻辉，3，4，5，6*

(1.包头医学院，内蒙古 包头 014060；2.额济纳旗蒙医医院，内蒙古 阿拉善盟 735400；3.内蒙古自治区特色药用植物培育与保护工程技术研究中心，内蒙古 包头 014060；4.内蒙古自治区特色道地药材资源保护与利用重点实验室，内蒙古 包头 014060；5.内蒙古自治区中医药研究所，内蒙古 呼和浩特 010110；6.广西药用植物园/广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，广西 南宁 530023)

胡杨PopulusdiversifoliaSchrenk.为杨柳科杨属植物，产于我国内蒙古西部、新疆、甘肃、青海。国外分布在蒙古、苏联(中亚部分和高加索)、埃及、叙利亚、印度、伊朗、阿富汗、巴基斯坦等地[1]。树脂入药，味苦、咸，性寒。具有清热解毒，制酸止痛的功效。用于咽喉肿痛，牙痛，淋巴结结核，胃、十二指肠溃疡，胃痛，胃酸过多；外用治中耳炎，痔疮[2]。该传统应用表明其功效可能与抗炎作用有关。故本研究以脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7构建炎症细胞模型，采用胡杨树脂提取物处理炎症模型，对胡杨树脂提取物进行活性筛选，探讨胡杨树脂提取物对细胞的抗炎效果。同时，本研究利用UPLC-Q-Exactive 四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪联用技术，对胡杨树脂的化学成分快速识别和鉴定[3-5]。以期为胡杨树脂的抗炎活性及化学成分研究奠定基础，为胡杨树脂的临床应用及综合开发提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

胡杨树脂采于内蒙古阿拉善盟额济纳旗，经内蒙古科技大学包头医学院李旻辉教授鉴定为杨柳科植物胡杨PopulusdiversifoliaSchrenk.的树脂。

小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库；DMEM高糖培养基(Gibco公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS，Sigma公司)；DMSO和青霉素、链霉素(海克隆生物化学制品(北京)有限公司)；噻唑蓝(MTT，sigma公司)。

甲酸、乙腈、异丙醇(色谱纯，天津市永大化学试剂有限公司)；超纯水(沈阳欣洁科技有限公司)。

1.2 仪器

Thermo 311 CO2培养箱(Thermo公司)；SW-CJ超净台(上海新苗医疗器械制造有限公司)；XDS-1B倒置显微镜(上海比目仪器厂)；Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪(Thermo公司)；台式离心机(Thermo公司)。

UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(Thermo公司)；Thermo Scientific Accucore aQ 色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm，Thermo公司)；BT125D十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；DS2510DT超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司)。

2 方法

2.1 样品的制备

胡杨树脂提取物制备：称取胡杨树脂粉末250 g，采用超声提取法，用正丁醇超声提取3次(正丁醇用量为2000 mL、2000 mL、1500 mL)，合并提取液浓缩至干。残渣加水溶解，用正丁醇萃取，将萃取液浓缩至干，即得胡杨树脂提取物。

胡杨树脂提取物样品：细胞实验前，将胡杨树脂提取物用超纯水配成200 mg·mL-1的母液，再用培养基稀释至所需浓度。

胡杨树脂供试品：称取胡杨树脂提取物150 mg，加异丙醇1 mL，超声60 min，离心后取上清，过0.45 μm滤膜，供液质联用分析。

2.2 细胞培养

小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7用含10%胎牛血清，100 mg·mL-1青霉素，100 mg·mL-1链霉素的DMEM培养液于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞用于后续实验[6]。

2.3 胡杨树脂提取物对RAW 264.7细胞增殖的影响

RAW 264.7细胞按每毫升1×105个接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度(12.5、25、50、100、200 μg·mL-1)的胡杨树脂提取物样品。同时设空白对照(未加胡杨树脂提取物)，每组设置5个平行孔，培养24 h后，每孔加入新配制的5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，终止培养。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min后，用酶标仪测量各孔的吸光度值(OD 570 nm)，根据公式(1)计算细胞存活率[7-8]。

(1)

2.4 胡杨树脂提取物对LPS诱导RAW 264.7细胞炎症的保护作用

取对数生长期RAW 264.7细胞按1×105个·mL-1接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度(12.5、25、50、100、200 μg·mL-1)的胡杨树脂提取物样品，保护4 h后加入终浓度为1 μg·mL-1的LPS。设空白对照组、LPS组，LPS+胡杨树脂提取物组，每组设置5个平行孔，培养20 h后，每孔加入新配制的5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，终止培养。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min后，用酶标仪测量各孔的吸光度值(OD 570 nm)。

2.5 色谱及质谱检测条件

色谱条件：Thermo Scientific Accucore aQ (2.1 mm×100 mm，1.9 μm)色谱柱；流动相为0.1%甲酸水溶液(A)，乙腈(B)，梯度洗脱见表1；流速为0.4 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量为5 μL。

表1 梯度洗脱色谱条件

质谱条件：离子源为HESI源，正离子检测模式，鞘气压力206.84 kPA；辅助气体积流量15.22 L·min-1；喷雾电压3.5 kV；离子传输管温度320 ℃；辅助气温度350 ℃；扫描模式Full MS/dd-MS2，full MS分辨率70 000；dd-MS2分辨率17 500，扫描范围m/z100～1500。MS/MS时，碰撞能40 eV。

3 结果

3.1 胡杨树脂提取物对RAW 264.7细胞增殖的影响

采用MTT法检测胡杨树脂提取物对小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞增殖活性的影响。结果显示，与空白组比较，胡杨树脂提取物不同浓度(12.5、25、50、100、200 μg·mL-1)对RAW 264.7细胞的增殖作用无显著性差异(P>0.05)。实验结果表明，在实验浓度范围内胡杨树脂提取物对细胞增殖无影响，无细胞毒性作用(图1)。

图1 胡杨树脂提取物对RAW264.7细胞增殖的影响

3.2 胡杨树脂提取物对LPS诱导RAW264.7细胞炎症的保护作用

与LPS模型组比较，浓度为12.5、25、50、100、200 μg·mL-1胡杨树脂提取物能显著改善LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7的炎症反应，具有较好的浓度依赖性(P<0.05)，表明该浓度下的胡杨树脂提取物对LPS诱导RAW 264.7细胞炎症具有较好的保护活性(图2)。

注：与空白对照组比较，***表示P<0.001；与LPS组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01。图2 胡杨树脂提取物对LPS诱导RAW 264.7细胞炎症的保护作用

3.3 化合物质谱分析

供试品溶液按2.1项中质谱条件进行分析检测后，利用TraceFinder 软件完成数据采集与处理。将全扫描模式的高分辨质谱数据通过MassFrontier 7.0软件进行分析，推导其可能的结构式。再将检测到的化合物的精确分子量试验值与理论值进行匹配，在Compound Discoverer 2.1软件自带的数据库mzCloud、中药成分数据库、Chemspider及Scifinder等进行检索，并结合化合物的一级、二级质谱及裂解规律进行分析和鉴定，推测鉴定出6个化合物。胡杨树脂(+)ESI-MS的质谱基峰离子流图见图3，已推测鉴定的各化合物保留时间、质谱信息见表2。

注：1棕榈油酸；2邻苯二甲酸二丁酯；3十六酰胺；4油酸酰胺；5硬脂酰胺；6芥酸酰胺。图3 胡杨树脂UPLC-Q-Exactive MS 的正离子质谱基峰离子流图

峰号保留时间/min准离子峰[M+H]+分子式二级碎片(m/z)化合物122.68255.23C16H30O2327.22,219.21,167.14棕榈油酸224.49279.15C16H22O4205.08,149.02邻苯二甲酸二丁酯330.00256.26C16H33NO116.10,88.07,57.07十六酰胺430.28282.27C18H35NO226.21,170.15油酸酰胺533.92284.29C18H37NO116.10,102.09,88.07,74.06硬脂酰胺637.02338.34C22H43NO282.27,149.02芥酸酰胺

3.4 棕榈油酸及十六酰胺结构解析

本实验主要对胡杨树脂中具有抗炎活性的化合物进行分析，通过高分辨质谱及二级质谱的碎片离子推测化合物结构式[3]，在此，以化合物1、3举例进行结构解析。

化合物1：棕榈油酸。结合正离子模式下质谱的分子离子峰m/z255.23[M+H]+，推断此化合物的分子式为C16H30O2，再根据化合物分子式找出二级质谱，发现谱图中有碎片离子m/z327.22、219.21、167.14，m/z237.22 [M+H-18]+是母离子失去一分子水，m/z219.21 [M+H-36]+是母离子失去两分子水，m/z167.14 [M+H-88]+是母离子失去C5H11O(图4)，结合文献推测此化合物为棕榈油酸[9-10]。

图4 化合物1提取离子质谱图

化合物3：十六酰胺。结合正离子模式下质谱的分子离子峰m/z256.26[M+H]+，推断此化合物的分子式为C16H33NO，再根据化合物分子式找出二级质谱，发现谱图中有碎片离子m/z116.10、88.07、57.07，m/z116.10 [M+H-140]+是母离子失去C10H20，m/z88.07 [M+H-168]+是母离子失去C12H24，m/z57.07 [M+H-199]+是母离子失去C12H25NO(图5)，结合数据库检索进行匹配，推测此化合物为十六酰胺。

图5 化合物3提取离子质谱图

4 讨论

胡杨树脂，又名胡杨泪、胡杨碱，为胡杨树干的分泌物。《本草纲目》载：“胡杨泪，胡杨树脂也，故名泪”。具有清热解毒，制酸止痛的功效。主治咽喉肿痛，牙痛，淋巴结结核，胃、十二指肠溃疡，胃痛，胃酸过多；外用治中耳炎，痔疮。但是，迄今为止其化学成分和药理活性的系统研究基本处于空白。因此，有必要对胡杨树脂进行系统研究，以充分利用胡杨的药用价值。

本研究基于胡杨树脂的传统功效，探讨其抗炎活性。利用LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7构建炎症模型，采用MTT法对胡杨树脂进行活性筛选，结果表明胡杨树脂在12.5、25、50、100、200 μg·mL-1浓度下具有显著改善LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症反应的作用，且表现出较好的浓度依赖性。同时，本研究利用UPLC-Q-Exactive 四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪联用技术，对胡杨树脂的化学成分快速识别和鉴定推测出6个化合物。其中的化合物1推测鉴定为棕榈油酸，棕榈油酸是一种ω-7单不饱和脂肪酸，可以调节身体代谢，影响炎症标记物和 PPAR代谢通路，对炎症有一定的治疗效果[11-13]；化合物3推测鉴定为十六酰胺，十六酰胺已被证明可与细胞核的一种受体(核受体)结合，对于多种慢性疼痛和炎症相关的生物学功能产生影响。此外，化合物4油酸酰胺及化合物6芥酸酰胺为不饱和脂肪酸酰胺类化合物，有研究通过采用DPPH-HPLC方法证明了油酸酰胺和芥酸酰胺具有抗氧化的生物活性[14]。且有发明从圆锥铁线莲中分离得到一种酰胺类化合物金色酰胺醇酯，初步体外药理研究发现此酰胺类活性成分具有抗炎镇痛作用[15]。故推测胡杨树脂的抗炎活性可能与以上成分有关。

本研究结果为胡杨树脂化学成分的分离提取及其药理作用奠定基础，为胡杨树脂的临床应用及综合开发提供参考资料。但对于胡杨树脂的生理活性、有效成分及相关作用机制等还需进行深入的研究与调查。