乳酸菌用作口服疫苗表达载体的应用研究进展

亓秀晔，刘乃芝，程福亮，徐海燕，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司 山东省动物微生态制剂省级重点实验室，山东 泰安 271000）

疫苗是用病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法，制成的用于预防传染病的自动免疫制剂[1]。作为关乎人民群众健康、公共卫生安全及国家安全的特殊产品，接种疫苗在整个人类社会安全中起着重要作用。

活载体疫苗（live vector vaccine，LVV）是通过分子生物学手段将有效的目的抗原编码基因导入活载体（无或弱毒的细菌或病毒），从而构建重组菌（毒）株，使目的基因随着重组菌（毒）株在宿主体内的增殖而大量表达，从而诱发相应的免疫保护应答，是目前最具发展潜力的新型基因工程疫苗之一[2]。活载体疫苗可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，进而激发全身的黏膜免疫，具有特异性强、免疫效果持续稳定、诱导位点专一、免疫方式简单等优点，而且如果载体中同时插入多个不同病原的外源基因，就能实现一免防多病的目的，这都是传统疫苗无法比拟的优势。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是在人体、动物、植物和整个自然界中广泛分布的并公认的绿色安全级（generally regarded as safe，GRAS）微生物，是一群能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰氏阳性细菌，分属十几个。LAB主要通过在机体肠道内定植来改善肠道微生态环境，并具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏等益生作用及免疫调节等生理功效[3]。从21世纪初开始，国内外学者就开始致力于对LAB分子生物学及作用机制的研究，以乳球菌（乳球菌、粪链球菌等）、乳杆菌（干酪乳杆菌、植物乳杆菌、拉曼乳杆菌、嗜酸乳杆菌等）和双歧杆菌（长双歧杆菌、金双歧杆菌等）等作为基因工程受体菌，应用基因工程技术有目的、有选择地研制新型微生态制剂，以更好的控制其益生性状和免疫效果[4-5]。研究表明，像抗原、酶类、细胞因子、抗体、过敏原蛋白等一系列外源蛋白分子均可以在LAB中重组表达[6]。黏膜免疫的接种方式也是影响免疫效果的关键因素，消化道口服免疫和鼻腔免疫是目前重组乳酸菌疫苗使用最为广泛的黏膜免疫方式，至于两种免疫方式的效果比较目前还没有定论[7-8]，但是两种方式都可以通过胃肠黏膜进行抗原递呈，经不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应而产生的副作用远小于后者，动物实验和人体临床实验也验证了基因工程LAB对于多种疾病预防和治疗的有效性。

1 LAB用作口服疫苗活菌载体的优势

LAB作为外源基因表达宿主菌，其优越性主要表现在：（1）培养容易，操作方法（如电穿孔法转基因）简便，技术成熟，副作用少，成本低；（2）LAB作为GRAS益生菌，可直接口服，比一些减毒的载体更具有安全性，同时免去了目的蛋白的体外提纯等后续加工处理工序。LAB在发挥自身益生功能的同时，增强免疫效果，一举多得；（3）重组的LAB可用来表达不同类型的异源蛋白，比如嵌合的或非嵌合的抗原、细胞因子、各种酶等，同时还能将具有多种功能的药物分子串联表达，达到一免治多病的效果[9-11]；（4）可在细胞内表达也可在细胞表面表达和分泌到胞外[12]；（5）LAB对机体黏膜有极强的粘附作用，因此进入消化道、呼吸道、泌尿系统等在黏膜处不断繁殖，持续向机体释放特异性的目的抗原蛋白[13]；（6）具有免疫佐剂作用、固有免疫原性及对胆汁酸的抵抗力，不需要额外地提供外源性抗原刺激动物机体就能发生黏膜免疫和系统免疫[14-15]。因此，LAB作为基因工程受体菌的应用前景十分广阔。

2 LAB应用于活载体疫苗的研究

2.1 LAB载体分类及表达调控元件

许多LAB都被发现了质粒的存在，且数量各异，1个或多个。脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）杂交和核苷酸序列分析证实，小质粒同其他革兰氏阳性菌的线性质粒具有不同程度的同源性，一些LAB复制子宿主范围广泛，质粒间可以进行频繁的横向传递和重组，因而可在其他种类的革兰氏阳性菌及大肠杆菌中穿梭表达；此外，LAB质粒多为滚环复制，质粒分离相对稳定，可在宿主体内持续稳定的表达蛋白，LAB质粒的这些特点有助于其在宿主体内进行基因克隆和蛋白表达，因此，了解LAB的质粒载体系统是研究基因工程乳酸菌的首要步骤。（1）克隆载体：LAB中研究的第一个克隆载体的构建是在2个广宿主范围的复制子pWV01和pSH71的基础上发展起来的，后又逐渐衍生出许多新的质粒；另外一个广泛应用的复制子是从粪肠球菌中分离出的pAMbeta-1质粒，后又衍生出pIL252和pIL253[16]质粒。（2）表达载体：根据表达载体启动子类型的不同，LAB表达载体可分为两种类型：诱导型表达载体和组成型表达载体。目前应用最广泛的诱导型表达系统是乳链菌肽受控的表达（nisin-controlled expression，NICE）系统，是由乳链菌肽nisin控制的食品级高效诱导表达系统，缺点是需要在免疫重组菌株之前提前诱导才会获得高质量的蛋白表达[17]，如ENOUF V等[18]用NICE系统表达产生轮状病毒非结构蛋白4（rNSP4），可产生具有抗原和免疫原特性的rNSP4蛋白，且与病毒蛋白有相同的免疫原特性。组成型表达系统能够持续稳定的表达目的蛋白，不需要提前诱导，如从LAB中分离的组成型启动子P32、P59和P23己成功地用于pMG76e、PVE5523和pOri23等组成型载体的构建[19]，如JEONG D W等[20]以pMG36e载体为基础，使用来自于植物乳杆菌的半乳糖苷酶基因替代红霉素抗性标记基因，成功的在乳酸乳球菌中构建了分泌性表达载体。相对而言，乳杆菌的表达载体由于遗传多样性等问题发展较缓慢，常用的乳杆菌的载体有pWV01、pSH71和pAMbeta-1等[21]。乳杆菌的表达载体同样包括组成型启动子如Ppgm、Pldhl、Ps1pA和诱导型启动子[22]。

2.2 LAB表达载体调控元件的选择性标记

LAB表达载体的调控元件即质粒上都带有一个或多个特定的选择性标记基因。LAB选择性标记主要分为两类：非食品级标记和食品级标记。非食品级标记一般为常见的抗性筛选标记基因（如红霉素、氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素等抗性基因），可选择在加有这些抗生素的培养基里进行抗性压力筛选，然而在全人类无抗时代，抗性基因的携带易造成潜在危害。随着人们对食品安全问题日益重视，众多学者一直致力于高效、无毒副作用的食品级表达载体的研究。常用的食品级表达载体主要有：糖诱导表达载体、噬菌体Φ31爆发式诱导的表达系载体、乳链球菌素调控表达载体、pH值调控表达载体等，这类表达系统的基因载体、受体及诱导物均为食品安全级，可直接口服免疫。

2.3 LAB表达载体的应用

2.3.1 LAB表达载体在动物疫病防控上的应用

做好动物疫病防控工作意义重大，关乎全人类健康和福利。流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，传播速度快，易造成人畜共患病，危害较大。流感病毒分为甲、乙、丙3种类型，其中甲型流感病毒极易变异，可引起反复流行或大流行，20世纪几次著名的流感大流行均由甲型流感病毒引起[22]。甲型流感病毒的宿主范围非常广泛，它可以感染禽类、猪、马、狗、海洋生物、哺乳动物和人类等，甲型流感病毒可以分为16种血凝素（hemagglutinin，HA）亚型（H1～H16）以及9种神经氨酸酶（neuraminidase，NA）亚型（N1～N9）[23]，各亚型在宿主之间有一定局限性。

其中猪流感（swine influenza，SI）的病原是猪流感病毒（swine influenza virus，SIV），属于正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒[24]。目前没有正规的SI的疫苗，预防困难，从分子方面着手是有效的措施。M2e是SI基质蛋白M2胞外域的保守序列，包含24个氨基酸，M2e蛋白被认为可刺激机体产生免疫反应来应对多种流感病毒亚型的保护性抗原[25]。王倩[26]将植物乳酸菌NC8作为外源蛋白的递送载体，将SIV主要保护性抗原M2e蛋白基因与小鼠的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的Fc受体片段基因融合在一起，成功制备了含有pSIP409-3M2e-Fc的重组乳酸菌口服疫苗，并发现重组口服疫苗对小鼠有显著的免疫效果（P＜0.05）。NS1蛋白是SIV基因组中唯一的非结构蛋白，保守性较高，具有可以加快病毒复制，扰乱宿主免疫系统的作用，并且由于其结构的独特性可以用来到区分感染动物和免疫动物。YANG WT等[27]通过将NS1基因与穿梭载体相连构建重组质粒pSIP409-pgsA-NS1并导入植物乳酸菌NC8，成功构建了新型功能乳酸菌口服疫苗，此款口服疫苗能提高感染SI病毒小鼠的存活率，对甲型流感病毒（H1N1）型SIV有一定的保护作用。这为SI的防治提供了有力证据。

禽流感（avian influenza，AI）的病原是禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）。目前常用的防控AI有效的途径是疫苗，但由于AIV抗原容易变异易导致疫苗防控存在局限性，影响了疫苗的免疫效果。HA是AIV的血凝素，具有强烈的抗原性，HA2在AIV的各个亚型之间是相对保守的，是制备通用型疫苗的候选抗原。YOON A W等[28]进一步利用pgs A蛋白将HPV-16衣壳蛋白L2于干酪乳杆菌（L.casei）表面进行展示，证实该菌株除了能介导机体产生全面的免疫应答以外还能对多种其他亚型的乳头瘤状病毒产生交叉中和反应。为新型微生态制剂的研制提供了依据。SHIS H等[29]研究发现，口服表达甲型流感病毒（H9N2）HA的植物乳杆菌，诱导免疫小鼠产生粪便IgA、细支气管IgA及血清免疫球蛋白，二级淋巴器官的B细胞水平也提高了，CD8+T细胞增殖水平和干扰素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）分泌水平有了很大的改进，相当于典型的流感疫苗的水平，最重要的是，致死量攻毒后免疫小鼠幸存下来；此作者在接下来的研究中利用树突状细胞诱导肽作为佐剂的试验中也表现出了同样的结果，口服表达甲型流感病毒（H9N2）HA的植物乳杆菌提高了免疫鸡只的免疫应答和攻毒保护率[30]；WANG Z等[31-32]在BALB/c小鼠和鸡上的甲型流感病毒（H5N1）HA1试验中，抗体和T细胞水平出现一致的结果。LEIH等[33]将HA抗原成功展示重组乳酸乳球菌的菌体表面，重组菌单独或和霍乱毒素单位B（cholera toxin subunit B，CTB）一起口服免疫实验动物，然后对小鼠攻毒致死剂量的甲型流感病毒（H5N1）病毒，结果发现，在添加CTB的试验组中检测到了明显滴度的HA特异性血清IgG以及粪便IgA，细胞增殖试验和IFN-γ酶联免疫斑点试验的结果揭示了细胞免疫应答的发生，更重要的是，CTB与重组乳酸菌联合免疫组的小鼠能够抵抗致死剂量的H5N1病毒感染。这与CHOWDHURY M Y E等[34]的研究结果一致，作者用表达霍乱毒素单位A（cholera toxin subunit A，CTA1）共轭基质蛋白-2（conjugated consensus matrix protein-2，sM2）构建重组干酪乳杆菌，并将重组干酪乳杆菌对小鼠进行粘膜免疫，结果发现重组干酪乳杆菌是诱导小鼠对多种流感亚型产生保护性免疫应答。

仔猪病毒性腹泻主要是由猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和猪轮状病毒（porcine rotavirus，Po RV）单独或混合感染引起，该病对仔猪的危害较大，病死率高[35-37]。3种病毒引起的发病猪临床症状和病理变化都非常相似，并且常常存在混合感染，防止比较困难[37]。该3种病毒目前均没有特效的药物，单纯靠疫苗接种并不能完全防治仔猪腹泻。

TGEV与PEDV同属于尼多病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus），S蛋白是TGEV与PEDV结构蛋白中唯一能诱导中和抗体的产生和提供免疫作用的蛋白。HO P S等[38-39]分别成功构建了以TGEV S蛋白为目的基因的TGEV重组干酪乳杆菌和nisin诱导型表达S蛋白的乳酸乳球菌，抗原蛋白均得到高效表达，口服重组菌免疫Balb/c小鼠检测到血清中sIgG抗体和肠洗液IgA含量明显升高，且抗体菌具有病毒中和活性，这些结果证明了所构建的重组菌能够诱导免疫小鼠产生局部免疫和全身性免疫反应。赵艳丽等[40]将TGEV S1基因克隆到pMD18-T载体并成功电转化至乳酸乳球菌NZ3900中并表达了S1蛋白，表达产物具有反应原性，表达蛋白位于菌体表面；薛瑞雪[41]以SA基因为基础，成功构建含有TGEV的A、D抗原位点和乳酸杆菌质粒基因Rep.8014的重组真核质pRc/CMV2-SAD-Rep.8014并电转到猪源乳酸杆菌中，口服重组菌疫苗能够刺激机体产生较高水平的体液免疫和细胞免疫，同时可以促进脾脏T淋巴细胞的增殖及IFN-γ、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）的产生，尤其在刺激产生黏膜抗体中具有显著的刺激作用。KONJUFCA V等[42]以重组沙门菌和重组腺病毒作活载体构建PEDV疫苗，产生有效针对病毒的局部黏膜免疫应答和全身免疫反应；LIU D Q等[43]研究表明，通过表面表达PEDV S1蛋白和N蛋白（不是通过分泌），抗S1和抗N的抗体水平显著增加，特别是在眼和鼻分泌物中；HOU X L等[44]在干酪乳杆菌表面表达了PEDV N蛋白，小鼠和猪口服重组PEDV N蛋白和S1蛋白的干酪乳杆菌后，虽然不产生中和抗体，但能激发高水平黏膜IgG、sIgA和非中和抗体的全身免疫反应。

轮状病毒是引起婴幼儿及其它多种动物如猪、羊、火鸡等的脱水性肠胃炎的主要病原之一，轮状病毒重组乳酸菌的保护作用的两种主要途径已经在小鼠上得到验证。第一个途径是利用干酪乳酸菌进行典型的口服免疫，在小鼠体内诱导产生了黏膜IgA和抵抗Po RV主要保护性抗原VP4的血清中和抗体IgG[45]；第二个途径是利用抗体片段提供保护，ALVAREZ B等[46]在鼠李糖乳杆菌表面表达了一个抵抗RV的抗体片段，在幼鼠模型上产生了抗腹泻的保护性。Po RV的VP4和VP7是刺激机体产生中和抗体的重要抗原。GAO S Y等[47]成功构建了表达Po RV的VP4蛋白和共表达VP4与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的重组乳酸乳球菌和干酪乳杆菌表达系统，口服免疫小鼠后，不仅可刺激局部肠道黏膜产生免疫应答，同时诱导产生了体液免疫应答和细胞免疫应答。周晗[48]成功构建了表达Po RV的VP7蛋白的重组干酪乳杆菌pPG-1-VP7/L.casei393，口服免疫小鼠，可诱导机体产生局部粘膜免疫应答和系统体液免疫应答；MARELLIB等[49]成功将RV蛋白VP8在细胞质表达，分泌到细胞外并展示到菌体表面的重组乳酸杆菌并免疫小鼠，研究表明，口服免疫含有pL1质粒乳酸菌（LL1）的小鼠产生了显著水平的肠黏膜抗体而接种含有pL3质粒乳酸菌（LL3）的小鼠则产生了肠黏膜和系统水平的抗VP8抗体，LL1免疫组的肠黏膜抗体的保护率达到50%，LL3免疫组的血清抗体保护率达到100%。这些令人鼓舞的结果描绘了轮状病毒疫苗发展的新方向。

随着生物技术的发展，越来越多的病毒群已经利用乳酸菌载体系统进行靶向研究。例如，猪瘟病毒为猪的黄病毒属，已经在兔、小鼠和猪上进行了试验，所有试验显示均产生了血清抗体和黏膜抗体，特别是在猪上的试验中，胸腺素α-1和T细胞激活肽的出现，能够提高IgG、IgA，IFN-γ、IL-2和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平[50]。猪细小病毒已经在BALB/c小鼠和猪上进行过研究，出现明显的IgG和IgA的反应，以及攻毒保护和病毒中和反应[51]。鸡新城疫病毒是一种主要侵染家禽的副粘病毒科病毒，在细菌上增加了树突状细胞诱导肽（dendritic cell induc ing peptide，DC-pep）后，与未添加DC-pep相比，鸡只产生了强的新城疫保护性免疫反应，不仅提高了粘膜和血清抗体水平，同时也增加了外周血和脾脏中的T辅助细胞水平[52]。口蹄疫病毒，一个困扰偶蹄动物的小核糖核酸病毒，将口蹄疫病毒乳酸杆菌活载体疫苗口服免疫豚鼠，不但可以刺激机体产生较强的系统免疫应答，而且还诱导机体发生较强的黏膜免疫应答，攻毒保护性实验证实该重组乳酸菌疫苗能够在疾病发生的早期发挥防控作用[53]。

2.3.2 LAB在代谢产物调控方面的应用

LAB代谢产生乳酸及其他多种代谢产物，它们共同改善发酵食品特有的风味、质地和营养价值。通过基因工程手段人为地加入或敲除某些基因来有效地增加或抑制某些代谢产物的形成，这为开发新功能型发酵食品具有重要意义。如在乳球菌丙酮酸代谢途径中，敲除乳酸脱氢酶基因或过量表达NADH氧化酶，可以使乳酸菌大量地产生双乙酰代替乳酸；在乳球菌中引入外源性基因如丙氨酸脱氢酶基因，可使乳酸菌大量产生L-丙氨酸代替丙酮酸。在乳球菌中过量地表达叶酸或核黄素生物合成的关键酶，可以促进这两种B族维生素的生物合成；在对乳酸菌胞外多糖生物合成途径中的限制性步骤如糖基转移酶的产生进行调控，可以有效地提高胞外多糖的产量。一些乳杆菌属，已被用作具有促进健康特性的商业益生菌培养物[54]。杨欢等[55]将草酸脱羧酶（oxalate decarboxylase，ODC）和草酸氧化酶（oxalate oxidase，OXO）基因与表达质粒pMG36e重组，通过电转化将重组质粒转入乳酸菌MG1363中，成功构建重组pMG36e-ODC和pMG36e-OXO乳酸菌，两者都可在含100 mmol/L草酸的培养液中生长，pMG36e-ODC重组乳酸菌喂养可显著降低高草酸饮食大鼠尿液，中草酸含量，这对治疗尿石症提高重要理论依据。SANFÉLIX-HAYWOODN等[56]将多糖代谢关键酶-α-磷酸葡萄糖变位酶基因pgm利用pT1NX表达载体电转化到植物乳酸菌BL310中，成功使胞外多糖产量增加了172%；VAN K R等[57]将产胞外多糖代谢关键酶引导糖基转移酶eps-D基因利用pNZ4055表达载体在乳酸球菌中过量表达，结果发现胞外多糖产量提高15%。除胞外多糖外，还有乳酸以及类黄酮等代谢物的生产。寇田田[58]在质粒pMG36e的基础上构建的pMG36e-dsred2基因工程菌，实现了一步法生产乳酸，提高了乳酸的产量。SCHUMANN C等[59]利用表达载体pSIP409将苹果酸乳酸酶基因（mle）克隆到植物乳酸菌WCFS1中，发现重组菌加速了乳酸的发酵。LIU D Q等[43]利用载体pNZ8149将大豆查尔酮异构酶基因（CHI1A）进行克隆表达，为生产类黄酮奠定基础。

3 结语与展望

LAB作为益生菌，其应用前景巨大，尤其是伴随着基因工程技术逐渐的进步，构建LAB表达系统表达生物活性蛋白或传递外源保护性抗原的条件已逐渐完善。无抗时代的到来，LAB作为无抗性筛选标记的候选人责任重大，基因工程乳酸菌的安全问题涉及到全人类的食品安全观念更是深入人心。首先，当前许多外源性抗原基因的表达都是在体外进行的，无法精确的模拟其体内的表达及作用过程；其次，即使可以体外模拟外源抗性基因的表达，表达的抗原是否能够与黏膜组织的免疫系统广泛接触，控制重组乳酸菌在动物消化道粘附和定植；再次动物机体免疫耐受力下降也是是将来研究的重点；此外，重组基因工程乳酸菌潜在的风险如致病性、抗药基因转移造成的感染、致病性细菌的过度繁殖和变异无法控制性等都需要考虑到。因此，怎么让机体对表达所需抗原的乳酸菌都可以引起所需、高效持久的免疫应答等都是当前面临的最大的问题。可想而知，伴随着研究技术的不断提高，我们将会获得品质更加良好的基因工程乳酸菌，这对于生产实践的应用有着深远的意义。