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S3-1 Effects of XXM on Learning and Memory in Rats with Chronic Cerebral Ischemia

CHENG Xiao，YANG Ying-lin，ZHANG Jun，WANG Yue-hua，DU Guan-Hua

Beijing Key Laboratory of Drug Target Identi fi cation and Drug Screening，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

【ABSTRACT】 Objective：Vascular dementia （VD） refers to a progressive decline in memory and cognitive function caused by chronic cerebral hypoperfusion. Xiao-Xu-Ming decoction （XXM），a wellknown traditional Chinese herbal prescription，has been widely used to treat stroke. The present study was to investigate the possible mechanism of XXM in rats with chronic cerebral ischemia.Methods：2-vessels occlusion （2-VO） by permanent occlusion of bilateral common carotid arteries has been widely used as a model of VD. After XXM treatment for 4 weeks，the rats underwent Morris water maze and prehensile traction test. Neuronal morphology was observed using Nissl and HE staining. The activity of SOD and the content of MDA in brain tissue were determined. The protein expression of DJ-1 and GAP was determined by Western Blotting.Results：Compared with 2-VO model group，XXM signi fi cantly improved learning and memory and the grasping ability. In addition，XXM signi fi cantly reduced brain tissue pathological injury induced by 2-VO. Furthermore，XXM signi fi cantly increased SOD activity and enhanced DJ-1 and GAP expression in the hippocampus of brain.Conclusion：XXM could signi fi cantly attenuate the cognitive impairment，limb balance dysfunction and pathological injury in rats with chronic cerebral ischemia. The mechanism may be related to improving the antioxidant system in vivo.

【KEY WORDS】vascular dementia （VD）；chronic cerebral hypoperfusion （CCH）；bilateral common carotid arteries occlusion （2-VO）；learning and memory

基金项目： 国家自然科学基金面上项目（No.81473383），国家科技重大专项重大新药创制（No.2018ZX09711001-003-019），中国医学科学院医学与健康科技创新工程（No.2016-I2M-3-007），北京协和医学院研究生创新基金（No.2017-1007-02）

作者简介：程笑，在读博士生

通讯作者：王月华，E-mail：walling@imm.ac.cn；杜冠华，E-mail：dugh@imm.ac.cn

S3-2 钠依赖性高血压导致认知功能障碍

郭翠苹 王小川

华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系，神经系统重大疾病教育部重点实验室，武汉，430030，中国

【摘要】 目的：尽管越来越多的研究认为高血压与脑功能之间存在联系，但高血压是否构成认知功能衰退及其内在机制尚不清楚。因此我们建立了钠盐依赖性高血压模型，来探索是否会导致认知功能损伤，以及导致认知功能障碍的分子机制。背景：高血压是动脉血压持续升高的病理过程。高血压通常不会引起症状，然而，长期高血压是冠状动脉疾病、中风、心力衰竭、外周血管疾病、视力丧失和慢性肾病的主要危险因素。最近的研究表明，高血压也可能在认知功能障碍，血管性痴呆和阿尔茨海默病（Alzhimer’s disease，AD）的发展中发挥重要作用。一项来自4年评估的纵向研究发现，高血压患者的认知障碍风险增加了2.8倍。在高血压患者中，使用抗高血压药物治疗的痴呆发生率比高血压患者低30%。这些研究强烈支持高血压（blood pressure，BP）和认知功能之间存在紧密关系，而且这种联系在生物学上很复杂并且还没有完全理解。神经影像学显示高收缩压与较小的区域和总脑容量有关，随着时间的推移脑容量减少。然而，高舒张压并不影响脑容积。慢性高血压破坏脑自动调节并减少静息脑血流。脑灌注不足可能与突触蛋白合成功能障碍有关。导致内皮功能障碍的高血压破坏了神经元，神经胶质和微血管系统中脑血流的协调耦合。方法：运用旷场实验，条件恐惧实验、Morris水迷宫、Western Blot、高尔基染色、尼氏染色、免疫组化及激光共聚焦等手段和技术，检测动物学习记忆、突触可塑性、突触相关蛋白变化等。

实验结果：

1. 长期高盐摄入会导致收缩压显着增加，伴局部脑血流量下降。

2. 条件恐惧反射和Morris水迷宫行为测试表明，高盐饮食诱导海马依赖性空间参考记忆缺陷

3. 高盐依赖的高血压导致神经元树突棘明显减少，不影响神经元的数目的减少。

4. 高盐引起细胞内钙的减少，使CaMK II失活并导致CREB的Ser133位点去磷酸化，从而导致神经元的损伤，最终影响认知功能。

结论：高盐饮食诱导细胞内钙外移，致CaMK Ⅱ失活并导致Ser133处的CREB去磷酸化，并伴局部脑血流量下降和神经元树突棘发生减少，最终导致认知功能障碍。

通讯作者：王小川，E-mail：wxch@mails.tjmu.edu.cn

S3-3 Calcineurin与α-synuclein之间的相互作用受钙/钙调素调节

时晓雨 孙 越 魏 群 骆 静

北京师范大学生命科学学院，基因工程药物与生物技术北京市重点实验室

【摘要】 目的：Calcineurin（CN）是目前发现唯一的、Ca2+/CaM依赖的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，参与一系列Ca2+依赖的信号转导途径。研究表明CN-NFAT信号通路与α-synuclein（α-syn）介导的中脑多巴胺神经元的退化有关。因此研究CN和α-syn之间的相互作用对于了解它们的结构和功能、神经退行型疾病的致病机理都是非常重要的。方法：GST原核表达质粒的构建；蛋白纯化；微量热涌动（MST）；免疫共沉淀（Co-IP）；GST Pull-down实验；酶活力测定。结果：①利用GST亲和层析原理，得到了纯度较高的α-synuclein蛋白。纯化的α-syn蛋白用于MST实验，测定体外条件下CN的A亚基与α-syn的结合，解离常数为（6.89±3.89） μmol·L-1。②Ca2+离子是CN的激活剂，能够使CaM与CNA结合，而EGTA能够螯合溶液中的Ca2+离子，进而阻断CaM与CNA结合。我们发现Ca2+/CaM显著加强了α-syn与CN的结合。推测α-syn与CN的结合依赖于Ca2+/CaM的存在，可能的情况是α-syn与激活状态下的CN结合。③体外条件下检测α-syn对CN活性影响，无论是RII测活法还是PNPP测活法，α-syn均能使CN活性增加，且存在剂量依赖性，最高达到30%。之后我们在稳转α-syn还是稳转α-syn的HEK293细胞中利用免疫共沉淀的方法发现，α-syn与CNA存在相互作用。④毒胡萝卜素（thapsigargin，TG）作用细胞后，自噬相关蛋白LC3II含量上升。稳转α-syn的细胞，TG组α-syn的含量明显多于对照组，推测TG在引起细胞自噬的同时，可能也导致了α-syn其他代谢途径受阻（如蛋白酶体-泛素化途径等）以及自噬下游路径受阻。TG作用后，细胞中CN活性升高，这可能是由于TG能够引起胞质内的Ca2+水平升高。可以看出TG对α-syn的代谢影响较大，但其机制还有待进一步研究。结论：纯化的CN能够与α-syn结合；Ca2+/CaM能够提高两者的相互作用，这些结果有助于我们更好地理解α-syn与CN信号通路之间的相互关系。

基金项目：国家自然科学基金项目（No.81373389）

S3-4 基质辅助 激光解吸附电离质谱成像在脑缺血性痴呆药物治疗研究中的应用

许嘉旻1，2李 婉1，2刘润泽1，2蒲小平1，2

1. 北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京，100191，中国

2. 北京大学药学院分子与细胞药理学系，北京，100191，中国

【摘要】基质辅助激光解吸附电离质谱成像（matrix-assisted laser desorptionionization mass spectrometry imaging，MALDI-MSI）是一种能够在组织切片上原位检测大量分子含量和空间分布的技术。MALDI-MSI的基本原理为利用均匀分散的基质液滴，在生物组织切片上通过提取作用溶解样品中的各类分子，形成共结晶，在激光的高能量作用下，解吸形成的离子一同进入飞行时间质谱（time-of- fl ight MS，TOF-MS）或者其它类型的质谱仪器，依次检测单个像素点的离子信号，全部像素点的信息再由软件重构能形成物质在组织上的分布图谱。MALDI-MSI早期主要用于多肽和脂质的检测，近年来MALDI-MSI已经可以运用于小分子的检测，例如刘会会等人运用1，5-二氨基萘基质能够检测到代谢小分子的信号。由于MALDI-MSI技术具有高通量原位成像的特点，将其应用于中枢神经系统疾病和相关药物治疗的研究中，有助于疾病机制和药物作用机制的探索。我们实验室已经在左旋奥拉西坦和丁基苯酞的脑缺血性痴呆药效药理学研究中应用MALDIMSI检测代谢小分子的变化，以系统的阐明药物的作用机制。首先我们实验室在永久性结扎双侧颈总动脉所致的慢性脑缺血（两血管结扎法，two-vessel occlusion，2-VO）大鼠认知障碍模型中评价了左旋奥拉西坦的治疗效果，并采用MALDI-MSI技术系统的研究了在2-VO模型急性缺血期左旋奥拉西坦对脑内小分子空间分布变化的影响。采用MALDI-MSI技术，分析了2-VO模型急性缺血期左旋奥拉西坦对小分子空间分布变化的影响。在左旋奥拉西坦治疗后的大鼠皮层缺血区域，我们共鉴定出15种发生变化的代谢小分子，其中8种小分子的变化在LC-MS/MS检测中得到了验证，分别是腺苷二磷酸（ADP）、腺苷一磷酸（AMP）、鸟苷一磷酸（GMP）、谷氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰天冬氨酸、谷胱甘肽和抗坏血酸，左旋奥拉西坦能够在急性缺血期增加大鼠皮层ATP的代谢、谷氨酸-谷氨酰胺循环和抗氧化剂的含量，保护脑缺血组织，改善2-VO导致的认知障碍。此外，我们实验室构建了永久性大脑中动脉闭塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）大鼠模型，用MALDI-MSI检测了丁基苯酞治疗后大鼠脑组织中小分子分布变化情况。我们发现丁基苯酞能够改善pMCAO大鼠的神经学严重程度评分，并且通过MALDI-MSI实验发现，丁基苯酞能够促进pMCAO大鼠模型脑组织缺血灶的ATP代谢，提高抗氧化剂水平和维持钠-钾离子平衡。我们实验室的工作表明了MALDI-MSI在脑缺血性痴呆药物治疗的研究中能够发挥重要作用，我们也会进一步在相关领域开展与MALDI-MSI相关的研究。

【关键词】基质辅助激光解吸附电离质谱成像；脑缺血性痴呆；药物治疗；代谢小分子

通讯作者：蒲小平，E-mail：pxp2020@126.com

S3-5 以五脏视角探讨认知功能障碍的病因病机

侯俊林 詹向红

河南中医药大学基础医学院，郑州，450046，中国

【摘要】中医学认为认知功能是神的一部分，脑主神明而五脏藏神。五脏功能状态对于认知功能障碍相关疾病发生均有影响。肝有主疏泄和主藏血的生理功能。肝主疏泄，调畅气机，有助于气血津液的流通。若肝失疏泄，则气血运行不畅，留滞为瘀，阻塞清窍，可致脑之机能衰退，出现认知障碍。肝主疏泄，还可促进脾胃消化。若肝失疏泄，则影响脾胃的消化功能，致饮食水谷化生气血的过程受阻，进而使气血乏源而影响脑功能的发挥。肝主藏血，即肝能贮存血液，调节血量。如果肝藏血的功能发生异常，则其贮存血液和调节血量的能力下降，从而使脑窍得不到足够的血液供应而神机衰退。心有主血脉和主藏神的生理功能。心主血脉，主要包括心主生血和行血两个方面。心主血脉功能异常，一则影响血液化生，导致血虚；二则血运无力，脉道阻塞，终可致心脑供血不足或瘀堵而神机不灵，认知功能衰退。心主藏神，又称心主神明。心所藏之神，既有调控五脏六腑的功能，又有统帅精神、意识、思维活动的功能。脾有主运化，主生血的生理功能。脾主运化包括运化水谷和运化水液。脾主运化功能失常，一则化生水谷精微的能力下降，无法满足脑神运转所需，二则无法及时运化水液，使水液集聚，聚湿成痰，阻塞清窍，两者均可致神机失用，认知功能减退。脾主生血，是指脾运化所产生的水谷精微是生成血液的主要物质基础。若脾失健运，则气血生化乏源，导致血液亏虚，脑失濡养而灵机消减。肺有主气和主宣发肃降的生理功能。肺主气功能失常，一则影响呼吸之气，使脑部缺氧，二则影响全身之气的生成和运行，致脑窍受累，认知功能下降。肺的宣发肃降功能，有助于布散脾转输于肺的水谷精微和津液，以滋润脏腑组织。肺的宣发肃降功能失常，则水谷精微和津液布散受阻，可致脑失濡养而神机不灵。肾主智，主要是因为肾具有藏精的生理功能。肾藏精，是指肾可以摄纳、贮藏精气。肾中所藏之精包括先天之精和后天之精。先天之精可化生脑髓，后天之精可充养脑髓。脑为髓海，是肾精汇聚之处，只有肾精充足，才可保证脑的发育和其功能的正常发挥。因此，五脏的功能状态均可影响脑神。五脏协调运转才能顺利化生精气血津液，并避免痰浊瘀血的形成，保证脑神功能的正常发挥。因此，对于认知功能障碍相关疾病的治疗，不应根据经验囿于脾、肾等某一脏腑，而应该综合考虑患者身体状况特别是五脏功能，辨证施治。

【关键词】五脏；认知功能障碍；脑神

基金项目：国家自然科学基金（No.81173148，No.81473556）

作者简介：侯俊林，男，讲师，博士；研究方向：情志与衰老相关疾病的理论及临床；E-mail：houjunlin2005@163.com

通讯作者：詹向红，女，教授，博士，博士研究生导师