P-糖蛋白在神经元中的表达及氧化应激对P-糖蛋白的影响

白如冰 张忠泉 岑 娟

河南大学天然药物与免疫工程重点实验室，河南大学药学院，开封，475004，中国

1 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的简介

P-gp是一种由1 280个氨基酸组成，分子量为170 KD的跨膜糖蛋白，属于三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）依赖型（ATP-binding-cassette，ABC）转运蛋白家族一员［1］。P-gp广泛存在于生物体的正常组织中，尤其在具有生理屏障和分泌功能的组织和器官中呈高表达状态，P-gp是血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的重要组成部分［2］。P-gp 是一种能量依赖性药物外排泵，当外来物质或者细胞代谢物进入细胞后，P-gp与外来物质结合的同时也与ATP结合，利用ATP水解释放的能量将其泵出细胞，从而维持细胞内正常浓度，限制有害物质在脑内滞留。这既是机体生理状态下的自我防御保护，也是导致脑内药物浓度降低，引起多药耐药（multidrug resistance，MDR）的主要原因之一［3］。近年来，随着科学研究的发展，越来越多的研究表明P-gp在癫痫、脑缺血、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等神经系统疾病的发病和治疗中担任重要角色［4］。而药物干预也往往从P-gp入手，通过靶向制剂使药物选择性的集中在病灶区域，增加药物的浓度，降低毒副作用［5］。

2 P-gp在神经元中的表达

神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位，有接受、传递和整合信息的功能。许多神经系统疾病最明显的病理变化就是神经元的损伤与凋亡。如：癫痫患者最显著的病理变化是病灶区神经元的异常放电［6］；AD主要病理特征为神经元外β-淀粉样蛋白（amyloid-β protein，Aβ）聚集形成老年斑、神经元内的tau蛋白异常磷酸化聚集形成神经纤维缠结和相关脑区突触及神经元丢失［7］；PD表现为黑质多巴胺能神经元进行性丢失等［8］。在脑内，P-gp主要分布在微血管的内皮细胞膜和脉络丛的上皮细胞表面［9］。生理情况下，P-gp主要表达在BBB毛细血管内皮细胞上，而在神经元和胶质细胞上不存在表达［10］。但是有研究表明，在一些疾病状态下，P-gp在神经元上也存在表达现象［11］。

2.1 癫痫

癫痫状态下，P-gp不仅在脑血管内皮细胞上表达，而且在神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞等细胞中均出现过表达现象［12］。丁宁等［13］在海人酸（kainate，KA）致癫痫的大鼠海马区观察到神经元部分丢失，排列疏松，胞体皱缩，形态不规则。Western-blot结果显示，KA致癫组海马区P-gp表达与对照组相比明显增多。在毛果芸香碱诱导的癫痫大鼠模型中，癫痫状态持续24 h后，除了内皮细胞P-gp表达外，脑内海马区神经元上也出现P-gp的表达［14］。在 3-巯基丙酸（3-mercaptopropionic acid，3-MPA）诱导大鼠癫痫反复发作，免疫组织化学法观察到，除了在血管中表达P-gp，在大鼠的海马、纹状体也检测到P-gp的荧光染色［15］。以上结果提示，癫痫发作后，脑内P-gp的表达主要集中在海马部位，在内皮细胞上显著表达的同时，在神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞上也存在过表达 。大量动物模型以及人脑组织研究表明P-gp的过度表达与难治性癫痫的多药耐药性呈正相关。

2.2 脑缺血/再灌注损伤

目前，P-gp在脑内表达的研究主要集中在内皮细胞上。大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型中，大鼠脑缺血再灌注90 min后，内皮细胞上P-gp就出现过表达［16］。MCAO缺血再灌注模型中，大鼠缺血再灌注2 h后，可见BBB处血管内皮细胞上P-gp表达升高，在缺血损伤侧皮质、纹状体的血管内皮细胞和神经元上也出现了P-gp的阳性表达［17］。不同实验模型和实验方法研究脑缺血后P-gp的表达变化，发现缺血后P-gp在神经元细胞上有表达［18］。

2.3 神经退行性疾病

Aβ沉积是导致AD的主要因素，有效减少Aβ在脑内的沉积是最有效的治疗途径之一［19］。有实验［20］发现利伐斯的明通过上调P-gp和低密度脂蛋白受体相关蛋白，增加其在BBB上的清除能力，从而降低了老年大鼠的Aβ。这证明了P-gp对Aβ有外排作用。同时有研究表明在AD转基因小鼠模型中，P-gp蛋白水平降低，恢复P-gp的表达能有效减少Aβ的积聚［21］。有研究报道［22］在AD患者脑内组织的海马区微血管内皮上P-gp的表达显著低于正常水平。周丽等［23］用新生海马脑片培养技术，用Aβ诱导建立AD模型，经免疫组织化学方法观察到海马脑片组织中神经元受损，数目减少。在百草枯诱导的PD模型中发现，模型组脑内黑质阳性神经元数目明显减少，P-gp显著降低，而且P-gp随着时间的增多逐渐降低，与时间呈负相关作用［24］。这有可能是低表达的P-gp影响了脑内神经毒性物质的外排，增加了致病因素。

3 氧化应激影响P-gp的表达

3.1 氧化应激对P-gp的影响

在细胞新陈代谢过程以及对环境刺激时，好氧生物体中的氧都会不断产生活性氧反应物（reactive oxygen species，ROS）。他们是由不完全的单电子还原形成的小分子或离子，包括自由基，如：超氧阴离子（O2·-），羟基自由基（OH·），过氧烷基自由基（RO2·）和烷氧自由基（RO·），以及氧化剂或者易于转化为自由基的非自由基物质，如过氧化氢（H2O2），次亚氯酸（HOCl），臭氧（O3）和单线态氧（1O2）等。氧化应激（oxidative stress，OS）是指机体的氧化与抗氧化平衡失调，且表现偏向于氧化的形态。机体在受到缺血、缺氧、中毒等外界刺激时，体内的ROS可大量产生，从而使机体出现氧化应激反应并且导致许多疾病、发育异常和衰老，如癫痫、痴呆、脑缺血/再灌注损伤、动脉粥样硬化等。研究发现ROS和P-gp的表达有着密切的联系。D-P40细胞用H2O2处理后P-gp表达增加，加入抗氧化剂后P-gp表达下降，说明氧化应激可以诱导P-gp的表达［25］。许多实验表明ROS调控P-gp与许多信号分子和信号转导通路有关，如核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、PI3K/AKT 信号通路、活化分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）信号通路等。

Nrf2是CNC亚家族转录因子的成员，最初通过与抗氧化应答元件（antioxidant response element，ARE）结合而被认为是II期解毒和抗氧化基因的主要调节因子［26］。许多基因（包括ABC转运蛋白基因家族）作为MDR的关键调节因子，受Nrf2依赖性信号调节。Jeddi F［27］等人发现在胃癌患者样本中Nrf2的表达显著增高，同时P-gp表达上调，应用Nrf2表达性抑制剂可以显著下调P-gp的表达，证明Nrf2和P-gp之间存在关联性。

PI3K/AKT信号传导通路是细胞响应胞外生存和生长的信号转导途径。许多研究表明在肿瘤细胞中，ROS持续生成主要激活PI3K/AKT信号通路，并进一步促进癌症的发展［28］。目前已报道P-gp介导的MDR在肿瘤化疗失败中起关键作用，并且在不同类型的肿瘤中发现了PI3K/AKT细胞转导通路的异常激活，与多种恶性肿瘤的P-gp表达相关。本课题组［29］研究发现，人乳腺癌细胞MCF-7用H2O2作用20周后，细胞内P-gp的表达增多，细胞耐药性增加，使用特异性PI3K抑制剂LY294002可以显著降低ROS诱导的P-gp表达水平。Zhang B［30］等人通过研究甲烷对脑缺血再灌注的研究发现，甲烷可以显著降低MDR的水平，主要是增加了AKT磷酸化的表达。使用PI3K抑制剂和AKT抑制剂后，甲烷对ROS引起的神经损伤保护作用显著降低。这说明甲烷可能是用过激活PI3K/AKT信号传导通路降低ROS引起的MDR的表达。

MAPK家族是重要的信号调节激酶，主要通过调节细胞代谢、有丝分裂、炎症反应等影响细胞的生长和死亡。MAPK参与了P-gp的表达，当使用特异性MAPK抑制剂阻断MAPK信号通路时，P-gp的表达也会降低［31］。MAPK家族主要有ERK1/2、JNK、和P38。多种生长因子受体、营养相关因子受体等都需要ERK1/2的活化来完成信号转导过程。有研究表明磷酸化的ERK1/2在神经元、胶质细胞以及内皮细胞上均有表达，并且在缺血损伤侧半暗带的呈高表达状态，这表明ROS影响ERK1/2的表达。此外，由于ROS不仅是氧化应激的损伤分子，更参与了机体的正常信号转导通路，研究表明当今针对脑缺血的抗氧化治疗临床效果的局限性也可能与其对ROS的粗放干预有关，ROS的过量降低可能导致P-gp的表达增加，更不利于神经保护药物进入脑区发挥作用［32-34］。

PKC是一种细胞质酶，主要分布在细胞质中，呈非活性构象，在第二信使的存在下，PKC将成为膜结合的酶，从而激活细胞质的酶，参与生化反应的调控，同时PKC也作用于细胞核中的转录因子，参与细胞信号的传递、细胞增殖、细胞分化、基因的表达等等。有研究表明ROS的某些信号转导过程是通过PKC的激活实现的，PKC同时也参与了MDR的调节。本课题组［29］研究发现，人乳腺癌细胞MCF-7用H2O2作用20周后，细胞内P-gp的表达增多，细胞耐药性增加，PKC信号通路被激活。

3.2 氧化应激诱导相关炎症因子对P-gp的影响

大量的研究显示，氧化应激诱发炎症反应产生。已知在中风急性期（数分钟至数小时），脑实质中释放的促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）或白细胞介素 -1 β（interleukin-1 β，IL-1 β）会诱导血管渗透性，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的过度表达和活性。因此，炎症反应加剧了BBB的破坏并且恶化了神经血管损伤［35］。Huang L［36］等人通过建立MCAO/再灌注模型，测定炎性细胞因子，包括 TNF-α，IL-1β和 IL-6，发现上述因子浓度增加，表明MCAO/再灌注损伤后氧化应激诱发炎症反应产生。维拉帕米是P-gp的底物，可以穿过血脑屏障反映P-gp的功能［17］。实验采用UPLC-MS/MS系统测定脑组织中维拉帕米浓度，发现P-gp的浓度显著增加，表明炎症对 P-gp 的表达产生影响，TNF-α、IL-1 β、IL-6 等炎症因子可以通过某些机制调节P-gp的表达。核因子-κ B（nuclear factor κ B，NF-κ B）是参与基因转录的蛋白质分子，参与炎症反应，调控多种基因的表达。NF-κ B活化可以上调P-gp的表达［37］。有学者发现，阻断NF-κ B可以降低P-gp的表达，其机制主要为MDR1基因启动子区存在NF-κ B亚基p65结合的转录调控位点［38］。

3.3 其他因素对P-gp的影响

研究表明很多细胞转录因子也参与P-gp的表达，如：缺氧诱导因子 -1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）。HIF-1α在脑缺血缺氧状态下表达增高。与多研究表明HIF-1α可调控MDR1基因的表达，诱导 P-gp的表达升高［39］。如 Tallis S 等［40］在模型组中观察到皮质神经元中HIF-1α的高表达。这种类似缺氧的状态可能是某些物质通过占据HIF-1α结合结构域引发的，从而阻止其降解并诱导其稳定化，进而导致P-gp过量表达。在脑缺血过程中，谷氨酸可在神经系统内大量释放或堆积，谷氨酸可以过度激活NMDA受体产生兴奋性神经毒性，从而活化环氧合酶 -2（cyclooxygenase-2，COX-2），上调 P-gp 的表 达。有研究表明多柔比星诱导的MDR1上调可能依赖于COX-2转录活性而非PGE2，这表明COX-2与MDR1表达之间存在因果关系［41］。Yan Y X等人［42］的实验表明COX-2抑制剂塞来昔布可以显著下调P-gp的表达和功能。还有研究发现，谷胱甘肽（glutathione，GSH）、热休克蛋白 70（heat shock protein 70，HSP70）、高迁移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB 1）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）［43-46］等，也可以改变P-gp的表达水平并且影响着其功能的正常发挥。

4 特异性调控P-gp的意义

P-gp作为一种特殊的转运蛋白，其转运物质的过程是复杂的，确切的机制目前也尚未完全阐明。基于P-gp吸收能量外排药物的特点、作用机制、构效关系等，至今发展到第三代P-gp抑制剂［47-48］。P-gp抑制剂主要作用是抑制P-gp的上调，从而增加治疗药物的浓度，达到预期的治疗效果。然而P-gp在人体广泛分布，例如肝脏、肾脏、脑、小肠和睾丸等多种器官均有表达，并各自发挥不同作用。对P-gp的非选择性抑制反而会干扰正常屏障组织的功能，因此如何特异性抑制病理性增加的P-gp研究意义更大［49］。现在研究已经证明P-gp在许多神经系统疾病如癫痫、脑缺血时表达增高，导致治疗药物不能进入脑内，使这些疾病临床疗效不尽人意。但是在一些神经退行性疾病如AD、PD中，P-gp的表达降低，不能有效的清除脑内有害物质，从而使有害物质在脑内蓄积，引发疾病。掌握脑内不同细胞、不同状态下P-gp的变化规律，在相应的时间窗内给予P-gp的抑制剂将会提高脑内药物浓度，从而提高药物的治疗作用［10］。探索P-gp表达影响因素、作用机制及寻找其有效的抑制剂，对其治疗将具有重要意义，如PI3K/Akt信号通路各分子的抑制剂和NF-κB抑制剂现已广泛应用于临床实验。本课题组研究表明，ROS与多种神经疾病及肿瘤耐药息息相关，ROS作为第二信使激活了大量信号通路发挥着病理机制下的P-gp调控［50］。因此，关注ROS对P-gp的特异信号作用对揭示P-gp在神经系统疾病中的作用、及其抑制剂开发等方面意义重大。