人参麦冬含片增强免疫力功能的实验研究

姜 艳，朱春冬，周丹英，余 琪

(1.浙江省中药研究所有限公司，浙江 杭州310023； 2. 浙江麦斯康莱医药有限公司，浙江 宁波315300)

中医认为肺气不足可导致机体抗病能力降低，易感染外邪，易感冒，多有畏寒、流清涕之症，与现代医学的免疫力低下症状一致[1]。传统经典复方生脉散最早记录于金代张元素的《医学启源》，“麦门冬，气寒，味微苦甘，治肺中伏火，脉气欲绝，加五味子、人参二味，为生脉散，补肺中元气不足”[2]。原方中人参甘温，益元气，补肺气，生津液，是为君药；麦门冬甘寒养阴清热，润肺生津，用以为臣；人参和麦冬合用，益气养阴之功益彰[3]。五味子为佐药，敛肺止汗，生津止渴。本研究对以人参和麦冬为主要原料研制的含片进行免疫力功能的研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 ICR小鼠，SPF级，雌性，体重18～22 g，由浙江省实验动物中心提供。

1.2 主要试剂与仪器 人参购于桓仁杏林堂参茸药材有限公司，麦冬购于慈溪蓥瑞药材专业合作社，山梨糖醇购于青岛明月海藻集团有限公司，Hank’s液购于北京百奥莱博科技有限公司，刀豆蛋白A(ConA)、印度墨汁、Giemsa 染液购于上海远慕生物科技有限公司，RPMI1640培养液购于杭州吉诺生物医药技术有限公司。分析天平购于METTLER TOLEDO公司，离心机、酶标仪购于Thermo Fisher Scientific公司，显微镜购于Leica Microsystems。

1.3 人参麦冬含片的制备 采用提取(8倍量水煎煮2次，每次1.5 h)、浓缩(减压浓缩，真空度-0.07 MPa～-0.09 MPa，温度：50～70℃)、微波干燥(真空度-0.07 MPa～-0.09 MPa，物料温度35～55 ℃)、粉碎(过14目筛网)、混合(与硬脂酸镁混合20 min)和压片等工序制备人参麦冬含片。人参麦冬含片的粗多糖(以葡萄糖计)含量为1 g/100 g，总皂苷(以人参皂苷Re计)含量为600 mg/100 g。

1.4 免疫力功能考察 小鼠饲养环境室温20～25℃，相对湿度40%～70%。实验设三个剂量组和阴性对照组(蒸馏水)。低、中、高剂量分别为0.5、1.0、3.0 g/kg，相当于人体推荐摄入量的5、10、30倍。每天灌胃一次，连续灌胃一个月，每组10只小鼠。参考文献[4]进行免疫功能试验。

1.4.1 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验 分别制备各组灌胃后小鼠的脾细胞悬液，在脾细胞悬液中加入ConA液，T淋巴细胞受其刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)分解为蓝紫色结晶而显色，在570 nm波长处测得的光密度值(OD)减去不加ConA液的样品的OD值为光密度值差，反应淋巴细胞的增殖情况。

1.4.2 绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠迟发型超敏反应(DTH)试验(足跖增厚法) 对各组灌胃后小鼠腹腔注射SRBC进行免疫，4 d后在小鼠左后足跖部皮下注射SRBC，24 h后测定左后足跖部厚度，以前后足跖厚度差值来表示迟发型超敏反应的程度。

1.4.3 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法) 对各组灌胃后小鼠腹腔注射SRBC进行免疫，制备免疫小鼠的脾细胞悬液。SRBC与脾细胞悬液一起孵育，脾细胞悬液中的抗体生成细胞分泌的抗体与SRBC结合，激活补体可形成肉眼可见空斑，溶血空斑数反应了抗体生成细胞活性。

1.4.4 小鼠血清溶血素测定(血凝法) 对各组灌胃后小鼠腹腔注射SRBC进行免疫，采集各组免疫小鼠血清，SRBC与血清中抗体(溶血素)结合，在补体参与下发生凝集，观察血球凝集程度，计算抗体积数。

1.4.5 小鼠碳廓清试验 各组灌胃后小鼠尾静脉注射印度墨汁，碳颗粒经血流带到肝脾等处，进而被这些部位的巨噬细胞吞噬清除。注入墨汁后2 min，10 min分别从内眦静脉丛取血20 μL加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，在600 nm波长处测定值，并称定各组灌胃后小鼠的体重、肝、脾重量，根据两个时间点的值计算系数K=(lg1-lg2)/(t2-t1)，吞噬指数=体重/(肝重+脾重)×K1/3。

1.4.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(滴片法) 对各组灌胃后小鼠腹腔注射SRBC进行免疫，提取各组免疫小鼠的腹腔巨噬细胞并与鸡红细胞一起孵育，Giemsa液染色，镜检，计数100个巨噬细胞并计数其中吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞；计数100个吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞并计数其中鸡红细胞的数量。吞噬率=吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数，吞噬指数=吞噬的鸡红细胞总数/吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数。

1.4.7 自然杀伤(NK)细胞活性测定(LDH测定法) 分别制备各组灌胃后小鼠的脾细胞悬液(含有NK细胞)作为效应细胞，淋巴瘤细胞(YAC-1)作为靶细胞，一起培养作为实验组；YAC-1与培养液一起培养作为自然释放组；YAC-1与1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40)一起培养，作为最大释放对照组。靶细胞受到NK细胞杀伤后，靶细胞内含有的乳酸脱氢酶(LDH)释放。在酶标仪490 nm波长下测定各组混合液的OD值，NK细胞活性=(实验组OD值-自然释放组OD值)/(最大释放对照组OD值-自然释放组OD值)。

1.4.8 脏器/体重比值 称量各组灌胃后小鼠的体重、胸腺和脾脏重量，计算胸腺/体重和脾脏/体重比值。

2 结果

2.1 对 ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力的影响 与阴性对照组光密度值差(0.081±0.053)比较，低剂量组(0.121±0.096)、中剂量组(0.162±0.091)、高剂量组(0.134±0.061)差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 对SRBC诱导小鼠DTH的影响 与阴性对照组左后足跖部24 h厚度差(0.050±0.025 cm)比较，低剂量组(0.092±0.019 cm)、中剂量组(0.102±0.033 cm)和高剂量组(0.088±0.019 cm)小鼠左后足跖部24 h厚度差值均增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 对小鼠抗体生成细胞的影响 与阴性对照组溶血空斑数(22.0±2.2个)比较，低剂量组(22.7±2.4个)、中剂量组(22.4±1.6个)、高剂量组(23.7±2.4个)差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.4 对小鼠血清溶血素影响 与阴性对照组抗体积数(58.7±11.3)比较，低剂量组(62.1±10.7)、中剂量组(67.4±9.0)、高剂量组(69.4±12.8)差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5 对小鼠碳廓清试验吞噬指数的影响 与阴性对照组吞噬指数(5.06±0.79)比较，低剂量组(7.32±1.52)、中剂量组(6.04±1.62)和高剂量组(5.89±0.97)的小鼠吞噬指数均增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.6 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响 与阴性对照组(吞噬率27.4±3.9%，吞噬指数0.34±0.05)比较，低剂量组(吞噬率27.2±2.7%，吞噬指数0.36±0.03)、中剂量组(吞噬率27.5±4.2%，吞噬指数0.36±0.05)、高剂量组(吞噬率27.7±4.2%，吞噬指数0.37±0.04)差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.7 对小鼠NK细胞活性的影响 与阴性对照组的NK细胞活性(68.8±4.0%)比较，中剂量组(82.9±5.5 %)和高剂量组(89.7±3.6 %)小鼠NK细胞活性均增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.8 对小鼠脏器/体重比值的影响 与阴性对照组(胸腺/体重2.74±0.68 mg/g，脾脏/体重5.09±1.00 mg/g)比较，低剂量组(胸腺/体重2.81±0.42 mg/g，脾脏/体重4.61±0.96 mg/g)、中剂量组(胸腺/体重2.88±0.43 mg/g，脾脏/体重0.36±0.05 mg/g)、高剂量组(胸腺/体重2.79±0.51 mg/g，脾脏/体重4.72±0.84 mg/g)差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

机体免疫功能主要分为特异性免疫和非特异性免疫，特异性免疫又分为细胞免疫和体液免疫。ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验和绵羊红细胞诱导小鼠DTH试验用于评价细胞免疫功能，抗体生成细胞检测和小鼠血清溶血素测定用于评价体液免疫功能，小鼠碳廓清试验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验用于评价单核-巨噬细胞功能(非特异性免疫)。NK细胞是没有T细胞和B细胞表面标志的淋巴细胞，具有非特异性杀伤作用。

人参麦冬含片由人参、麦冬组成，含有皂苷、多糖等有效成分。据文献报道[5-6]，人参具有促进小鼠脾淋巴细胞增殖，提高免疫因子含量的作用。麦冬具有提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用。本研究结果显示，人参麦冬含片三个剂量组均能促进小鼠迟发型变态反应，促进小鼠单核-巨噬细胞碳廓清作用；人参麦冬含片中、高剂量组能够增强小鼠NK细胞活性。人参麦冬含片在本研究中未体现增强体液免疫功能的作用。结果提示，人参、麦冬按比例配制的人参麦冬含片对正常小鼠在细胞免疫和非特异性免疫(包括单核-巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性)方面具有免疫增强作用。