微生物代谢组学及其在白酒酿造中的应用研究进展

王珂佳，邱树毅*

（1.贵州轻工职业技术学院 轻工化工系，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；4.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

代谢组学作为系统生物学的重要组成部分诞生于20世纪90年代初，是一门继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后迅速发展起来的新兴学科，它以生物体或细胞中所有相对分子质量1 000以下的小分子代谢产物作为研究对象，利用高通量、高灵敏度、高分辨率的现代仪器分析技术，结合模式识别等化学计量学方法进行定性和定量分析，揭示生物体或细胞相关代谢途径及其变化规律[1]。

微生物是自然界中分布最广、种类最多的物种。由于微生物系统相对简单，基因数据丰富以及对微生物生理特征了解全面，代谢组学在微生物领域被越来越广泛的应用。微生物代谢组学是代谢组学的重要研究领域，它主要是通过代谢图谱对微生物代谢产物进行定量、定性分析，研究代谢机制，监测和优化发酵工艺。1992年，ELMROTH I等[2]首次利用气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS），结合化学计量学方法检测了脂肪酸、氨基酸和糖类物质含量，以评估肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）在培养过程中的细菌污染情况，微生物代谢组学随之应运而生。目前，微生物代谢组学已被广泛应用于不同的研究领域[3]。近年来，利用代谢组学技术对微生物多样性，诱变育种，功能基因，代谢途径及其代谢产物功能进行研究成为了热门方向。

中国白酒历史悠久，经过六千多年的演化，形成了以大曲、小曲或大小曲联用作为糖化发酵剂的固态发酵工艺[4]。该工艺是一个复杂的微生物混合协同作用过程，尤其在制曲和发酵环节，大曲、小曲等糖化发酵剂中的微生物利用自身酶系代谢和与原料作用代谢所产生的香气物质进入白酒中，形成复杂而协调的酒体风味。近年来，微生物代谢组学技术被应用于白酒酿造中微生物菌落结构分析、产酶及代谢途径研究[5-7]。在白酒生产过程中，通过对酿酒微生物细胞内代谢物质的分析来揭示风味物质的产生机制，实现发酵过程的动态监测，并据此优化发酵条件，改善酒体风味质量。本文围绕微生物代谢组学的研究内容、研究过程及其在白酒风味物质定性、定量研究和酿造工艺优化方面的研究进行了概述，分析了微生物代谢组学在白酒酿造应用研究中的优势和不足，为今后更好的利用微生物代谢组学解析白酒风味形成、发掘微生物多样性资源和优化生产工艺奠定基础。

1 微生物代谢组学的研究内容

1.1 微生物分类鉴定

目前，常用的微生物分类方法有表型分类法和基因型分类法。表型分类法是根据微生物形态学、生理生化学、生态学等的相似程度分群归类；基因型分类法是指利用现代分子生物学技术，如16S rDNA测序，DNA杂交以及聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）指纹图谱等对微生物系统发育相关性进行分类[8]。一般情况下，细胞在基因水平上存在细微差异都会在最终代谢产物上被体现出来，产生明显不同的代谢表型，因此新兴的代谢物图谱分析技术成为一种全面、快速、高通量的微生物分类鉴定方法。ADNANI N等[9]利用液相色谱-质谱联用技术（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法对海洋微生物的代谢物进行分析并鉴定出12个小单孢菌科。TRIEST D等[10]利用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法（liquid chro matography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS-MS）方法在临床上鉴定真菌和其他微生物。CHENG C等[11]利用液相色谱-质谱联用和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术对46株从12种不同的海洋海绵物种中分离出的放线菌进行代谢组学分析鉴定，显示其分别为链霉菌（Streptomyces）SBT348和小单孢菌（Micromonospora）SBT687。SOGA T等[12]利用毛细管电泳-质谱联用（capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS）系统研究了芽孢发生时枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的代谢谱变化情况，识别出代谢物1692种，并鉴别出其中的150种。熊萍等[13]采用核磁共振氢谱（1H-nuclearmagnetic resonance，1H-NMR）代谢组学方法对变异链球菌（Streptococcus mutans）、血链球菌（Streptococcus sanguis）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的代谢物谱进行分析，成功检测了不同菌株细胞外代谢物的差别。SAMELISJ等[14]采用傅氏转换红外线光谱分析方法（Fouriertransform infrared spectroscopy，FTIR）获得了传统希腊Graviera奶酪中乳酸菌（Lactobacillus）胞外代谢物的红外光谱图，通过与数据库比较实现了乳酸菌的鉴定。DUSKOVA M等[15]通过比较基因型技术PCR、扩增核糖体DNA限制性分析（16S-amplified ribosomal DNA restriction analysis，16S-ARDRA）以及代谢物图谱分析技术基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDITOF-MS）对乳酸菌的鉴定能力，证明在种的水平上MALDITOF-MS更具有优势，且准确率达到93%。除了分类鉴定外，利用代谢物谱分析技术还可以进行突变体的筛选，曹晶晶[16]利用代谢图谱分析出拟南芥野生型与其突变体opr3存在明显的代谢物差异。柴振光[17]利用代谢物谱分析技术构建了盐芥激活标签突变体库和筛选出盐芥转座子标签的突变体。代谢组学在微生物分类鉴定领域的应用弥补了传统微生物分类鉴定手段的不足，正被更广泛地应用于愈加深入的研究中。

1.2 代谢物分析与鉴定

代谢物分析和鉴定是代谢组学研究的关键内容。质谱分析技术因其具有高灵敏度和高特异性，被广泛应用于代谢产物分析和鉴定。TAN K C等[18]采用气相色谱-质谱联用技术发现缺少Sch1基因的颖枯壳针孢（Septoria nodorum）突变菌株的次生代谢产物浓度是野生菌株的200倍，并鉴定该产物为交链孢酚。LOWE R G T等[19]采用GC-MS技术，非靶向分析了小麦病原菌孢子形成过程中相关代谢产物，证明壳聚糖在此过程中起着重要的作用。王越男等[20]采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）代谢组学技术研究了不同发酵方式生产的酸奶中益生菌的活性，结果表明采用单一益生菌发酵得到的产物和采用益生菌与传统酸奶发酵剂共同发酵得到的产物具有明显的不同，同时，通过UPLC-QTOF-MS鉴定38个代谢物，分析出了两种发酵方式得到的代谢产物的变化[21]。

1.3 发酵工艺研究

微生物通过发酵可以为人类提供诸如抗生素、酒类制品、功能食品及生物燃料等生活必需品。监控和优化发酵工艺，提高目标物产率和质量一直是相关领域的研究热点。近年来，代谢组学分析方法被用于对代谢物进行定性、定量分析，从而找到代谢途径或代谢网络中影响目标物质产生的关键反应，并针对靶标酶进行遗传改造，最终实现目标物产率及质量的提高。王向栋[22]以能够转化植物留醇生成9α-OH-AD的分枝杆菌（Mycobacterium）为研究对象，采用代谢工程的手段，对经过改造甾醇代谢途径中与目的产物合成相关的多个关键酶基因，而构建的高效合成9α-OH-AD的基因工程菌株，进行发酵过程工艺优化，进一步提高了目的产物9α-OH-AD的得率。陶瑞[23]构建了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的代谢组学分析方法，研究了植物乳杆菌及其3株亚油酸异构酶系基因敲除株和植物乳杆菌的代谢特征，从极性小分子和脂肪酸这两类代谢产物变化规律着手，进一步阐明了其生物转化共轭亚油酸差异的原因。邵明龙[24]以甾醇转化过程关键酶为目标，对新金色分枝杆菌（Mycobacterium aureus）转化植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（androsterone-1,4-diene-3,17-diketone，ADD）过程中的关键酶：3-甾酮-Δ1-脱氢酶（3-sterone-Δ1-dehydrogenase，KSDD）、胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase，Cho M）、甾酮C27单加氧酶（sterone C27 monooxygenase，SMO）和3-甾酮-9α-羟化酶（3-gonone-9-alpha-hydroxylase，KSH）进行研究，利用代谢工程策略，实现了ADD的高效积累。微生物代谢组学在发酵食品分析中的应用为发酵机理的研究提供了更准确、可靠的数据支持，进而为发酵工艺的优化提供明确的思路和方向。

2 微生物代谢组学的研究过程

微生物代谢组学的研究过程具有精确、灵敏、高通量等特点，通常包括样品制备和预处理，代谢物的检测、分析及鉴定和数据处理分析三个环节。

2.1 样品制备和预处理

样品制备和预处理是微生物代谢组学研究的初始步骤，包括快速取样、淬灭以及代谢物的提取。

2.1.1 快速取样

为防止底物浓度发生巨大变化，维持微生物代谢物稳定，一般利用连续扰动（Bio Scope）装置[25]和快速换膜过滤（fast Swinnex filtration，FSF）装置[26]进行样品的快速采集。其中，Bio Scope装置由连通发酵罐的透氧硅管组成，发酵液以恒定速度流过透氧硅管，管道中的塞子不断运动，使发酵液与扰乱剂混合开始扰动，根据发酵进程，在管道的不同位置对发酵液进行取样测定[27-28]；FSF装置依靠注射器、空压机等加压设备，使用压力驱动液体培养物通过Swinnex换膜过滤器进行快速过滤采样和样品提取，该方法可广泛应用于厌氧液体培养系统[26]。

2.1.2淬灭

快速取样后，需要快速淬灭酶活力，终止代谢反应，保持细胞完整性，从而获得特定时间内样品的真实信息。李泳榆等[29]应用高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪（high performance liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry，HPLC-MS/MS），分析不同浓度甲醇作为淬灭剂以及不同离心收获条件对鼠伤寒沙门菌胞内代谢物的泄漏影响及不同淬灭条件下DNA和蛋白质的渗出浓度，利用光密度回收率评估细胞完整性，结果表明使用-40℃体积分数为100%甲醇淬灭细胞并以3 000×g离心15 min收集菌体，胞内代谢物得到最大保留。VILLAS-BOAS S G等[30]提出了用冷甲醇溶液对酵母细胞进行淬火，然后用纯甲醇萃取胞内代谢物的方法。杨泓喆[31]采用预冷的体积分数60%甲醇/0.9%碳酸铵溶液淬灭、珠磨法破碎细胞和N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（N-methyl-N-（trimethylsilyl）trifluoroa-cetamide，MSTFA）衍生2 h，该方法从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中共鉴定到223种代谢物，包含了大量的氨基酸、有机酸和糖类物质。王亮[32]在研究酿酒酵母高浓度乙醇连续发酵体系振荡行为时，建立了以冷甲醇法和冷氯仿-甲醇-缓冲液法进行酿酒酵母细胞代谢淬灭的方法。

2.1.3代谢物的提取

代谢物提取是微生物代谢组学研究中的重要步骤，在设计提取方法时应遵循在尽量减少或避免代谢物发生物理或化学性质变化的基础上，提高提取回收率。常用的代谢物提取方法有冷甲醇、热甲醇、高氯酸或碱、氯仿-甲醇混合液以及乙腈等。其中，冷甲醇法的适用性较好，对磷酸化糖、磷酸化有机酸和氨基酸类代谢物具有较好的提取效率；高氯酸提取法适用于核苷酸类物质和水溶性代谢物提取；氯仿-甲醇法适用于非极性氨基酸、脂类等代谢物提取；乙腈法适用于极性代谢产物提取[33]。BERROU K等[34]基于搅拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）和顶空吸附萃取（headspace sorptive extraction，HSSE）的原理和对挥发性化合物更具特异性的优点，在顶空条件下用乙二醇/硅氧烷（ethylene glycol/silicone，EGS）搅拌棒和细菌培养条件下用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）同时提取，发现提取的化合物数量明显增加，为细菌挥发性代谢产物提取提供了一种新的方法。戴诗皎等[35]在检测浓香型白酒酒醅中总酯含量时，利用体积分数为95%乙醇浸提酒醅样品。张崇军等[36]研究表明，利用体积分数为55%的冷甲醇从大曲样品中提取出黄曲霉毒素B1效率最好。徐延等[37]研究表明，提取酱香型大曲类黑素的最佳工艺条件为乙醇体积分数40%，提取温度70℃，提取时间3 h，液固比17.5∶1（mL∶g）。然而，由于代谢物的多样性，通常很难通过单一的一种提取方法提取全部胞内代谢物，因此结合不同的方法有利于提高代谢物提取效果。

2.2 代谢物的检测、分析及鉴定

微生物代谢组学对代谢物进行检测、分析及鉴定的主要技术有色谱-质谱联用技术和核磁共振技术。

2.2.1 色谱-质谱联用技术

色谱-质谱联用技术具有较高的灵敏度和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定，是微生物代谢组学研究的常用方法之一。目前，气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）因其兼备色谱的高分离度、高通量及质谱的普适性、高灵敏度和特异性，被广泛运用到微生物代谢组学的研究中。陶瑞[23]通过利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）测定了植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的含量；白雪等[38]利用电子鼻和气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对乳品风味成分进行分析。随着技术发展，在微生物代谢组学研究领域相继出现了液相色谱-质谱联用（LC-MS）、全二维气相色谱-飞行时间质谱联用（full two dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）、离子色谱-电喷雾质谱（ion chromatography-electrospray mass spectrometry，IC-ES-MS）及毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）等技术。李俊等[39]采用顶空固相微萃取（headspace-solidphase microextraction，HS-SPME）与全二维气相飞行时间质谱相结合的方法，建立了白酒中挥发性风味成分分析方法，并对白酒中62种主要挥发性风味成分进行定性定量分析。

2.2.2 核磁共振技术

技术是目前微生物代谢组学研究的主要分析技术。能快速准确无损伤的对代谢产物中大多数化合物进行高通量分析并提供一定条件下的完整代谢图谱。李兵[40]利用1H-NMR技术检测白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌不同时段的代谢产物，绘制出了不同念珠菌（Candida）的特征性代谢核磁共振谱图。张亚飞[41]建立了一种方便、快捷、无损的低场核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技术对产盐霉素菌株发酵过程中培养基的大豆油含量进行检测。

2.3 代谢组学数据处理方法

通过色谱-质谱联用技术和核磁共振技术所获得的原始数据可采用K近邻法、连续K近邻法或多重插补法进行缺失值填补，应用正态、极差、均值、中位数、中心化或总强度标准化等方法进行预处理[42]，消除干扰因素后，利用主成分分析法（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘法（partial least squares，PLS）等进行统计学分析和生物信息学分析，再通过ECMDB、YMDB、HMP和KEGG等微生物代谢组学研究相关数据库，有效进行生物标志物鉴定，从而揭示目标代谢产物及代谢途径[3]。

3 微生物代谢组学在白酒酿造中的应用进展

3.1 白酒风味物质定性、定量研究

中国白酒酿造是以高粱、大米等谷物为原料，采用大曲、小曲或麸曲为糖化发酵剂，经过一系列复杂的酶化学反应、生化反应、有机化学反应及微生物代谢活动的过程。在此过程中，原料本身的香味物质，酒曲中微生物代谢产物、酒醅蒸馏中产生的香气物质及窖泥微生物代谢产生的香气物质，共同形成了白酒的风味物质[43]。目前，已经从中国白酒中检测出风味物质成分达300种以上，包括醇类、酸类、酯类、氨基酸类、羟基化合物、缩醛、含氮化合物、含硫化合物、呋喃类化合物、酚类化合物、醚类等[44]。根据风味物质不同，中国白酒主要分为了酱香型、浓香型、清香型及兼香型等10种香型，应该说风味物质直接决定了白酒的香型与质量。近年来，广大研究者利用气相色谱-质谱联用技术、多维气相色谱-质谱联用技术（multi-dimensional gas chromatography-mass spectrometry，MD-GC-MS）及气相色谱-闻香法（gas chromatography-olfac tometry，GC-O）等[45]微生物代谢组学研究手段对白酒中风味物质进行了定性、定量研究，为下一步研究其风味形成机制提供了理论基础。徐岩[45]利用气相色谱-闻香法（GC-O）研究了酱香型、浓香型、清香型、凤香型、药香型及兼香型白酒中的风味活性物质进行了系统研究，明确了浓香、清香、酱香等10种香型白酒的风味特征及重要风味物质及其微生物代谢机制，对提升白酒风味及其品质具有重要意义。刘燕梅等[46]采用顶空-固相微萃取结合气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术发现从浓香型白酒窖泥中筛选出的3株细菌的发酵产物主要为高级醇、高级酮等芳香类化合物，具有放香、助香及调香的作用，促进浓香型白酒风味形成。路江浩等[47]采用在线直接实时分析（direct analysis in real-time，DART）离子源串联四级杆质谱技术，建立了一种在线检测口腔中白酒挥发性风味物质释放过程的方法，有效监测白酒品尝过程中典型风味物质释放的时间-强度变化，为进一步研究白酒品尝中风味物质释放规律和余味形成机制提供技术支撑。陈华明等[48]采用气相色谱法对柔和酱香型和酱香型白酒中63种风味组分进行检测，结合嗅阈值计算各样品中风味组分的香气活性值（odor activity value，OAV），确定29种主要风味组分进行主成分分析，发现柔和酱香型白酒区别于酱香型白酒的特征成分主要集中在第2主成分中，包括糠醛、3-羟基-2-丁酮、丁酸乙酯、己酸乙酯、棕榈酸乙酯、2-丁醇、正丙醇、丁酸以及己酸。周森等[49]采用固态发酵实验对从牛栏山清香型大曲中分离酿酒酵母的可挥发性代谢产物进行了研究，发现其风味物质共28种，主要为酸、醇、酯3大类。何培新等[50]采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱研究了浓香型白酒窖泥中厌氧梭菌属（Anaerobic clostridium）细菌的挥发性代谢产物主要为酯类、酸类、醇类和醛类，对窖泥中厌氧梭菌挥发性代谢物分析，有利于生物强化白酒风味物质和溯源及控制白酒异嗅物质产生。黄月等[51]利用气相色谱质谱联用、测定了脱皮青稞黄酒、不脱皮青稞黄酒及青稞麸皮中挥发性和半挥发性风味物质，发现未脱皮青稞黄酒和脱皮青稞黄酒在挥发性香气成分上的差异主要来源于麸皮中富含的苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸通过代谢所产生的苯乙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇，3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基丙醇，表明青稞麸皮对黄酒风味的形成会生产积极影响。吴树坤等[52]采用固相萃取和气相色谱-质谱联用法（SPME-GC-MS）对沉香型酒醅中分离产香芽孢杆菌并进行了发酵风味分析，共检测到24种风味物质。综上，微生物代谢组学技术在各个类型白酒及白酒酿造各个阶段的风味物质鉴定方面的广泛的应用，为进一步研究白酒风味形成机制提供了基础，为不同风味白酒的酿造工艺优化及定向生产提供了理论支撑。

3.2 白酒酿造工艺优化

中国白酒独特的酿造工艺有利于形成特定的微生物群落结构，促进相关酶反应、生化反应及代谢活动发生，产生特有的风味，可以说“工艺”决定了“风味”。因此，为了改善白酒风味，提升品质，近年来，微生物代谢组学技术被大量应用于优化酿造工艺领域。邓剑清[53]利用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术检测强化高温大曲和普通高温大曲香气化合物组成，比较分析出两者共有的香气化合物有21种，其中强化高温大曲中酱香型白酒的香气成分的吡嗪类物质、苯甲醛、苯乙醇明显髙于普通高温大曲。将强化高温大曲应用于生产酱香型白酒，有利于酱香型白酒的品质提高。李莉莉[54]通过微生物代谢组学技术，结合表型分析对16株酿酒酵母在不同胁迫下的应激机制进行了研究，探讨了酿酒酵母耐性与发酵性能之间的关系，发现高温耐性和山梨醇耐性都会显著影响酿酒酵母的乙醇的生产能力，为利用酿酒酵母耐性的调控机制优化发酵工艺条件提供了理论依据。

4 展望

代谢组学作为一门新兴学科已被广泛地用于微生物代谢产物、发酵途径机制及发酵工艺监控优化等研究领域。目前，微生物代谢组学已成为了代谢组学的一个重要分支学科，但其在发展上存在以下几个方面的问题：①由于微生物培养条件的限制，导致了部分分析检测技术在使用上有局限；②微生物代谢组学数据库建设还不完善；③微生物代谢组学更多关注的是对代谢产物定性、定量研究，在相关代谢途径及机制研究上深入不够，特别在白酒酿造领域，目前主要集中在风味成分定性、定量研究方面，但对风味成分产生途径和机制研究还不够深入。因此，对于白酒风味物质的研究，应利用代谢组学原理探究酿造工艺的微生物代谢途径及机制，剖析其微生态作用过程，找到相关功能菌株，运用基因工程技术对功能菌株行改良和选育以获得强化菌株，将其运用于酿酒生产中，从而提高白酒品质、原料利用率和出酒率，实现“节能降耗、高产优质”的效果。同时，由此积累的经验和方法也将助推微生物代谢组学的发展。