PIK3CA及GST-π在人骨肉瘤多药耐药细胞株MG-63/ADM中的表达

丁万军，曾涛，张煜坤，肖祝雅，郭卫春，余铃，戈伟

武汉大学人民医院1肿瘤科，3骨科，武汉 430060

2武汉大学人民医院东院内分泌科，武汉 430075

骨肉瘤是较常见的骨恶性肿瘤之一，发病部位以股骨远端和胫骨近端最多见，发病年龄10～20岁者占60%[1]。截肢术曾经是骨肉瘤的标准治疗术式，但术后患者的5年生存率不足20%[2]。随着肿瘤化疗的发展，化疗联合保肢手术是新兴的治疗骨肉瘤的有效策略，可使患者的5年生存率提高近50%[3]。对于晚期骨肉瘤患者，化疗是其主要的治疗手段。然而有部分骨肉瘤患者因多药耐药而对化疗不敏感，导致治疗失败，这是影响骨肉瘤患者预后的主要原因之一[4]。因此近年来，关于骨肉瘤化疗耐药的机制及寻找逆转化疗耐药的新的靶点或药物，是骨肉瘤相关研究的热点和难点。

谷胱甘肽S-转移酶-π（glutathione-S-transferaseπ，GST-π）是细胞内解毒系统的关键组成部分，也是目前已经证实的与多药耐药密切相关的蛋白[5]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也称AKT）信号通路是近年来发现并证实的在人类多种肿瘤的发生、生长及侵袭过程中具有关键作用的信号通路，其在多种肿瘤中激活，参与肿瘤细胞的运动、抵抗凋亡等多个环节。有研究发现，PI3K/AKT在肿瘤的多药耐药中可能也发挥重要作用[6]。磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）基因编码Ⅰ类PI3K的p110催化亚单位。研究报道，在骨肉瘤中，PIK3CA较正常组织高表达[7]，但其作用机制，尤其是其与骨肉瘤化疗耐药的关系目前仍不明确。

本文采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测PIK3CA和GST-π在人骨肉瘤MG-63细胞及多药耐药细胞株MG-63/多柔比星（doxorubicin，adriamycin，ADM）中的表达水平，旨在探讨骨肉瘤中PIK3CA和GST-π表达情况与骨肉瘤化疗多药耐药的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人骨肉瘤MG-63细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心；RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝、二甲基亚砜购自上海碧云天生物技术有限公司；双抗（青霉素、链霉素）购自美国Gibco公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；ADM购自美国Sigma公司；细胞周期检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）检测试剂盒购自武汉科昊佳生物科技有限公司；蛋白抽提-亚细胞结构胞浆和胞核蛋白提取试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗人β-actin抗体和兔抗人PI3K p110α抗体均购自美国Thermo公司；鼠抗人GST-π单克隆抗体购自美国Santa公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自美国Millipore公司；细胞培养瓶及96孔培养板均购自美国Corning公司；细胞培养箱和自动细胞计数仪均购自美国Thermo公司；IX70倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司；Gel-Doc 2000凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；垂直电泳槽购自北京六一生物科技有限公司；JYECP3000型高压多用电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司；UV-1000紫外透射分析仪购自上海鄂禾仪器有限公司；Lambda Bio 20紫外-可见分光光度计购自美国PerkinElmer公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MG-63细胞多药耐药株的建立 将复苏的MG-63细胞移入5 cm×5 cm的细胞培养瓶内，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于5%CO2、37℃培养箱中培养、传代。依据文献[8]，先将低浓度的ADM作用于MG-63细胞，然后ADM的浓度逐步递增，通过间歇作用的方法诱导细胞耐药。①取对数生长期的MG-63细胞接种至含ADM的DMEM培养液中。②ADM从0.05 mg/L的低浓度开始，作用48 h后即弃去含ADM的培养液，加入新鲜培养液后继续培养。③待MG-63细胞恢复正常生长后行消化传代，在无菌操作台中打开培养瓶瓶盖，用一次性无菌巴氏吸管吸出细胞悬液，移至10 ml无菌EP管中，1000 r/min离心5 min。吸取离心后的上清液，加入3 ml新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养液，轻轻吹打制成单细胞悬液，吸取1 ml转入新的培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液补足至5 ml。在倒置显微镜下观察细胞密度及是否分布均匀，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。④采用浓度为0.1 mg/L的ADM处理传代培养的细胞48 h。按以上方法，重复ADM处理、换液培养、传代培养过程，在此过程中逐步递增ADM的药物浓度：0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/ml。将在2.0 μg/ml ADM中可以稳定生长时获得的耐药细胞株命名为MG-63/ADM，整个耐药诱导历时70天。实验过程中每4周重复检测1次MG-63/ADM细胞的耐药性。

1.2.2 MTT法检测MG-63/ADM细胞的耐药性培养MG-63、MG-63/ADM细胞至对数生长期。用0.25%胰蛋白酶消化后离心收集制成单细胞悬液，两种细胞均以1×104/孔接种于96孔板。置于DMEM培养液中培养24 h后分组。处理组：加入含2 μg/ml ADM的DMEM培养液；阴性对照组：加入不含药物的DMEM培养液；空白对照组：无细胞，只加DMEM培养液。每组设6个复孔。将各组细胞继续培养，取培养24、48、72 h的细胞进行MTT检测。按照MTT检测试剂盒中的操作步骤，每孔加入100 μl的MTT溶液，继续培养4 h后去除上清（不能移走结晶），每孔加入150 μl的二甲基亚砜，摇床低速振荡10 min溶解结晶，全自动酶标仪测定490 nm处的吸光度（optical density，OD）值。

细胞抑制率（inhibition rate，IR）=[1-（处理组OD值-空白对照组OD值）（/阴性对照组OD值-空白对照组OD值）]×100%。根据文献[9]中的方法，计算MG-63、MG-63/ADM细胞对ADM的半数抑制浓度（half effective inhibition concentrations，IC50），根据 IC50计算耐药指数（resistance index，RI）[10]。RI=MG-63/ADM细胞IC50/MG-63细胞IC50。

1.2.3 Western blot检测PIK3CA及GST-TT的蛋白表达 收集培养的MG-63、MG-63/ADM细胞，按细胞质和细胞核蛋白提取试剂盒说明分别提取细胞质、细胞核蛋白。应用96孔板按BCA蛋白定量试剂盒说明进行蛋白定量，每组3个复孔，紫外分光光度仪检测562 nm处的OD值，计算蛋白浓度。将蛋白调整到相同浓度，-70℃冻存备用。

每孔加入50 μg蛋白，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），电压为100 V，电泳2～3 h后转PVDF膜，转膜成功后置于5%脱脂奶粉封闭液中，37℃封闭2 h，PBST洗膜，加入一抗PI3K p110α、GST-π及β-actin（1∶10 000稀释），4℃过夜。第2天用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗膜后加通用型二抗（1∶5000稀释），37℃孵育1 h，洗膜后电化学发光法（electrochemiluminescence，ECL）曝光，曝光后的胶片依次显影、定影，室温晾干，扫描。采用Imagepro图像分析软件分析目的蛋白和β-actin的灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.2.4 RT-PCR检测PIK3CAmRNA和GST-πmRNA的表达水平 应用RT-PCR方法检测PIK3CAmRNA和GST-πmRNA的表达水平。选取与检测PIK3CA蛋白表达同样分组的6孔细胞，使用Trizol Reagent提取软骨细胞总RNA，紫外分光光度仪测量其浓度，-70℃保存。用Fermentas RTPCR两步法试剂盒行逆转录和PCR扩增。GST-π上游引物为5'-CCCAAGTTCCAGGACGGAGAC-3'，下游引物为5'-TCAGCAGCAAGTCCAGAGGF-3'，扩增片段为325 bp；PIK3CA上游引物为5'-CCTTGTTCAGCTACGCCTTC-3'，下游引物为5'-CATGGTGAACACGTTCTTGG-3'，扩增片段为565 bp；βactin上游引物为5'-CCTGACCGAGCGTGGCTACAGC-3'，下游引物为5'-AGCCTCAGGGCATCGGAAC-3'，扩增片段为205 bp。扩增条件：95℃预变性7 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，共30个循环；72℃5 min终止循环。将扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下观察扩增产物的特异条带。采用Band Scan 5.0软件行条带分析，测定条带的光密度（A）值。以β-actin作为内参，目的基因相对表达量=目的基因条带的A值/β-actin条带的A值。

1.3 统计学方法

应用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测MG-63/ADM细胞的耐药性

MTT检测结果显示，MG-63/ADM细胞对ADM的IC50和RI均明显高于MG-63细胞，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 MG-63和MG-63/ADM细胞对ADM的IC50及R（I±s）

表1 MG-63和MG-63/ADM细胞对ADM的IC50及R（I±s）

细胞类型MG-63细胞MG-63/ADM细胞t值P值0.16±0.07 1.97±0.56 7.856 0.000 1.00±0.12 11.35±2.40 10.550 0.000 IC50（μg/ml）RI

2.2 Western blot检测PIK3CA和GST-π蛋白的表达水平

Western blot检测结果显示，MG-63/ADM细胞中PIK3CA和GST-π蛋白的相对表达量均明显高于MG-63细胞，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2、图1）

表2 MG-63和MG-63/ADM细胞中PIK3CA和GST-π蛋白相对表达量的比较（±s）

表2 MG-63和MG-63/ADM细胞中PIK3CA和GST-π蛋白相对表达量的比较（±s）

细胞类型MG-63细胞MG-63/ADM细胞t值P值0.23±0.06 0.81±0.07 15.410 0.000 0.26±0.07 0.83±0.09 12.246 0.000 PIK3CA蛋白GST-π蛋白

图1 Western blot检测不同细胞中PIK3CA和GST-π的表达情况

2.3 RT-PCR检测PIK3CA mRNA和GST-π mRNA的表达水平

RT-PCR检测结果显示，MG-63/ADM细胞中PIK3CAmRNA和GST-πmRNA的相对表达量均明显高于MG-63细胞，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表3）

表3 MG-63和MG-63/ADM细胞中PIK3CA mRNA和GST-π mRNA相对表达量的比较（±s）

表3 MG-63和MG-63/ADM细胞中PIK3CA mRNA和GST-π mRNA相对表达量的比较（±s）

细胞类型MG-63细胞MG-63/ADM细胞t值P值PIK3CA mRNA 0.19±0.06 0.67±0.07 12.753 0.000 GST-π mRNA 0.22±0.04 0.74±0.06 17.664 0.000

2.4 PIK3CA和GST-π蛋白表达的相关性

Pearson相关分析结果显示，MG-63/ADM细胞中PIK3CA与GST-π蛋白的表达呈正相关（r＝0.866，P＜0.01）。

3 讨论

骨肉瘤是发病率最高的原发骨恶性肿瘤，以往主要的治疗手段是采取截肢手术，然而术后患者容易复发转移，导致预后极差。近年来随着骨肉瘤化疗的发展，患者的总体预后得到了极大的改善，化疗联合手术成为目前的标准治疗模式。但部分骨肉瘤患者存在原发多药耐药现象。多药耐药性是指对一种药物具有耐药性的同时，对其他性质不同、作用机制不同的肿瘤化疗药物也具有耐药性。多药耐药是导致肿瘤化疗失败的重要原因之一，并且已经成为影响这部分骨肉瘤患者预后的重要因素。因此，建立骨肉瘤多药耐药细胞株是体外研究其耐药机制的基础。

已有研究证实，通过持续诱导或大剂量间歇诱导等方法体外建立骨肉瘤多药耐药细胞株是可行的[10]。由于大剂量间歇诱导法更接近临床化疗实际，因此本研究采用了大剂量间歇诱导法。骨肉瘤化疗的主要药物包括铂类、蒽环类和达卡巴嗪等，其中ADM是骨肉瘤最主要的化疗药物之一[9]。本实验采取大剂量ADM间歇干预骨肉瘤MG-63细胞进行体外诱导，历时70天成功建立了骨肉瘤ADM耐药细胞MG-63/ADM，通过MTT法检测细胞的耐药性，结果证实MG-63/ADM细胞对ADM呈中度耐药，IC50为（1.97±0.56）μg/ml，RI为（11.35±2.40），说明该耐药株具有耐药性。

根据Krishna和Mayer[11]曾作出的分类标准，可将多药耐药分为两类：典型抗药机制与非典型抗药机制。典型抗药机制中多药耐药相关蛋白及P-糖蛋白（P-gp）发挥主要的抗药作用，非典型抗药机制中谷胱苷肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）及拓扑异构酶等在多药耐药中发挥主要作用。

GST是同源二聚体酶超基因家族的一种，有θ、μ、α、π等多种同工酶，其N端谷胱甘肽的结合位点含有酪氨酸残基，其羟基可以与硫醇化谷胱甘肽形成氢键，在催化反应中具有重要作用，C端为亲电子结合区，为底物结合位点[12]。GST-π催化谷胱甘肽（glutathione，GSH）的巯基，使其与多种体内或者体外来源的亲电化合物结合，结合后形成极性较大的复合物，这些复合物可以被多药耐药蛋白和P-gp等泵出体外，从而实现GST-π的解毒作用。但同时，大多数化疗药物也可被GST-π催化与GSH结合形成GSH-药物复合物，同样易被多药耐药蛋白泵出体外，使抗肿瘤药物在体内的作用时间变短，不能有效发挥作用，导致临床上发生肿瘤细胞多药耐药[13]。通常，GST-π高表达的肿瘤患者更容易耐药，因此临床用药中，GST-π含量可以作为制定肿瘤化疗方案的一个重要参考，有些易耐药的化疗药物就不适用于GST-π含量高的患者。GST-π除了通过直接的细胞解毒，还可以抑制凋亡的MARK通路，抑制肿瘤细胞凋亡而导致耐药[14]。本研究应用Western blot及RT-PCR方法检测人骨肉瘤MG-63细胞及耐药细胞株MG-63/ADM中GST-π蛋白及GST-πmNRA的表达水平，结果发现，MG-63/ADM细胞中GST-π蛋白和GST-πmNRA的相对表达量均明显高于MG-63细胞（P＜0.01），提示GST-π的过表达可能与骨肉瘤化疗耐药有关，但GST-π表达的调节机制仍不明确。

PIK3CA基因定位于染色体3q26.3，长度为34 kb，包含21个外显子。PIK3CA基因编码Ⅰ类PI3K的p110催化亚单位，即PI3K p110a。PI3K p110a具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性，促使AKT活化，活化的AKT可以磷酸化多种底物，参与调节细胞增殖、分化、迁移、凋亡等有关的信号通路，因此PI3K/AKT通路在细胞信号转导中发挥重要作用。约4/5的PIK3CA突变发生在螺旋区（exon 9）和激酶区（exon 20）这两个热点区域，其突变不仅可以减少细胞凋亡，还可以促进肿瘤浸润，提高下游激酶PI3K的活性，导致PI3K/AKT信号通路的激活[15]。PI3K/AKT信号通路是细胞生长、增殖和抗凋亡的重要调节因素，近年来研究表明其与肿瘤耐药的关系也十分密切。张栋等[15]研究发现，卵巢癌顺铂耐药机制与PI3K/AKT信号通路的异常有关，并且证实通过抑制PI3K/AKT信号通路能增强卵巢癌对顺铂的敏感性。Wang等[6]研究发现，PI3K/AKT信号通路的激活可以使结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性明显增加。O'Gorman等[16]研究发现，PI3K/AKT信号通路与HL60细胞的耐药有关，抑制该信号通路的激活可促进多种化疗药物诱导的HL60细胞凋亡。Gobin等[17]研究发现，PI3K突变频率高和（或）其在肿瘤细胞中的催化功能增加是骨肉瘤增殖转移的关键机制。但目前有关PIK3CA与骨肉瘤耐药关系的研究极少，本研究采用Western blot和RT-PCR方法检测人骨肉瘤MG-63细胞及耐药细胞株MG-63/ADM中PIK3CA的蛋白和mRNA表达水平，结果发现，MG-63/ADM细胞中PIK3CA的蛋白和mRNA相对表达量均明显高于MG-63细胞，差异有统计学意义（P＜0.01）。同时本研究发现，MG-63/ADM细胞中PIK3CA与GST-π蛋白的表达呈正相关，提示PIK3CA可能通过调控GST-π的表达影响骨肉瘤的化疗敏感性。

综上所述，人骨肉瘤耐药细胞株MG-63/ADM中PIK3CA和GST-π的mRNA和蛋白表达水平均明显高于人骨肉瘤MG-63细胞，提示PIK3CA及GST-π可能参与骨肉瘤多药耐药过程。同时PIK3CA与GST-π蛋白的表达呈正相关，提示PIK3CA可能是人骨肉瘤细胞GST-π介导的多药耐药的关键机制之一。