气相色谱-质谱联用法测定土壤中多类环境内分泌干扰物

丁 皓 吴小东 李长于

(1 浙江省环境保护科学设计研究院， 杭州 310007；2 浙江方圆检测集团股份有限公司，杭州 310018)

前言

1996年，欧洲委员会给出了内分泌干扰物的第一个定义：“改变生物体或其后代或(亚)人群内分泌系统功能的外源物质或混合物”。许多以不同化学结构为特征的天然和合成(或半合成)试剂具有破坏调节细胞生长，内环境稳定和发育的正常内分泌过程的潜力[1]。美国环保局1998年公布了67类危及人体和其他生物体的内分泌干扰物名单，这些化合物存在约86 000种商用化学品中，人群接触几率极大，此类物质在环境中存在时间长，并且只要极少量便会起到扰乱生物体内分泌的作用，造成免疫缺陷、异常生长发育、甚至长达多代的危害等各类疾病。目前，与废弃物污染相关的内分泌干扰物主要有邻苯二甲酸酯类[2-6]、己二酸酯类[7-10]、卤代联苯[11-13]和烷基酚类[14-17]等。

对内分泌干扰物进行及时准确检测，能有效预防环境中的内分泌干扰物造成的危害，是对内分泌干扰物进行预防和治理的关键步骤。目前较为常用的快速处理环境样品的萃取技术有：索氏提取、固相萃取、固相微萃取、超声波萃取、微波萃取、加速溶剂萃取和超临界流体萃取等。主要用到的检测方法为气相色谱法(GC)[18]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[9,19]、高效液相色谱法(HPLC)[20-21]和液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[22]。

就目前而言，国内的检测方法主要针对食品以及日用品等方面，并未充分重视对排放到环境中干扰物的检测，而且相比较于食品及日用品中内分泌干扰物较为单一的特点，排放到环境中的内分泌干扰物质种类多样，浓度低且来源广，只针对某一种内分泌干扰物的分析手段，在日趋复杂的环境检测任务中无法起到很好作用。在已报道针对水体和土壤的检测方法中，多集中于单独检测一类内分泌干扰物质，工作重复量大，耗时长且成本较高，应用于实际工作可行性不高，且内分泌干扰物在环境中的浓度较低即可导致危害的特点，相对应的分析手段通常需要较低的检出限。因此，开发出能对多类环境内分泌干扰物同时进行高效分析的检测方案，能有效避免上述缺陷，有利于对检测的规模化工作。

综上所述，若能开发合适的前处理技术，配合高效检测手段，开发对多种环境内分泌干扰物进行同时检测将极大有助于检测效率的提高，使之适合于环境相关的监测工作。

1 实验部分

1.1 仪器及材料

实验过程中所用到的仪器如表1所示，试剂及标准物质见表2。

表1 实验仪器

表2 实验试剂及标准物质

1.2 样品制备与前处理

将土壤样品放于常压下干燥，过0.25 mm孔径筛去除石块、植物根茎和其它较大颗粒，经粉碎机研磨，过0.12 mm孔径筛，保存于干燥器中待测。

称取制备好的土壤样品1.0 g于玻璃比色管中，加入0.01 mL内标标准中间溶液(浓度为10 mg/L)和10 mL丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶剂(分两次加入)，每次超声提取20 min，经离心后，合并提取液，用氮吹仪在40 ℃下吹至近干，准确加入1.0 mL正己烷定容，涡漩，作为待净化液。选用硅胶固相萃取柱(事先用10 mL正己烷活化)进行净化，将净化液过柱，待自然流干后，用10 mL洗脱液[二氯甲烷(90%)+丙酮(10%)]进行洗脱，收集洗脱液，用氮吹仪在40 ℃下吹至近干，加入1.0 mL正己烷定容，涡漩，过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.3 仪器工作条件

1.3.1色谱条件

色谱柱：HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)毛细管色谱柱；载气：氦气，纯度≥99.999%；进样口温度280 ℃；柱温条件：60 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率升温至280 ℃，保持8 min；流速1.0 mL/min；进样方式为不分流；进样体积1 μL。

1.3.2质谱条件

电离方式为EI；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；测定模式为全扫描(Fullscan)和选择离子监测(SIM)，质量扫描范围10～550 amu。

2 结果与讨论

2.1 内分泌干扰物的色谱分离

根据查阅的文献资料，邻苯二甲酸酯类、己二酸酯类、烷基酚类和多氯联苯类内分泌干扰物均可在非极性毛细管色谱柱得到较好分离。由于本实验涉及检测组份数目较多，且种类不同，为了保证一次能够分离多种物质，需要对仪器的条件参数进行调整。

实验中将配制的41种标准物质混合溶液，通过GC/MS全扫描和选择离子监测(SIM)获得41种目标化合物的总离子流色谱图(图1)及对应的质谱图，然后选择丰度高、干扰低的特征离子作为SIM(选择离子监测)定量离子，同时选择丰度较高、干扰较低的2～3种特征离子作为定性离子，通过对定性离子丰度比例的分析实现对目标化合物的定性，按此方法35 min内可完成41种目标化合物的分析测定。

由图1可以看出，在此操作条件下，待测的41种物质能较好地分离，其分离效果较好，能够在不同保留时间下出峰，故该操作条件可行。

图1 41种标准物质总离子流色谱图Figure 1 Total ion chromatogram of 41 standard substances.

2.2 提取方式的选择

振荡提取、索氏提取等传统的提取方法处理周期长、溶剂消耗量大。微波辅助提取、加速溶剂提取、超临界流体提取等仪器和技术成本相对较高。超声波提取法不仅能有效地将结构稳定的有机物从固体样品中提取出来，且具有效率高、仪器价格便宜、操作简单等优点。综合考虑，本研究选择超声波提取法提取土壤或底泥中这四类内分泌干扰物。

2.3 不同提取溶剂提取率的比较

取3份相同土壤样品1.0 g(精确至0.000 1 g)，加入10 mg/L的40种内分泌干扰物标准中间溶液0.1 mL，分别加入二氯甲烷、正己烷、丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶剂10 mL对土壤样品进行超声提取30 min，然后经离心，过滤膜上机测试。结果表明：二氯甲烷、丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶剂提取效果较好；正己烷提取效率除氯代联苯较好外，邻苯二甲酸酯、烷基酚和己二酸酯提取效率较差，回收率基本都在50%以下。研究发现，使用添加了丙酮的正已烷-丙酮(1∶1，V/V)混合溶剂体系对目标化合物提取效率较高，为测定土壤中内分泌干扰物的最佳提取溶剂。

2.4 超声提取时间的选择

图2 不同提取时间下内分泌干扰物峰面积-1Figure 2 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-1.

以丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶剂为提取溶剂时，考察5、10、20、30 min 4种不同的超声时间下样品提取率，确定最优提取时间(图2—5)。实验结果表明，随着超声时间的增加，目标化合物的提取率有所提高，在20、30 min超声时间下提取效果较好，同时，由于30 min的超声提取时间对目标化合物提取效率整体上有下降趋势，考虑目标化合物提取率及实验效率等因素，最终确定超声时间为20 min。

图3 不同提取时间下内分泌干扰物峰面积-2Figure 3 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-2.

图4 不同提取时间下内分泌干扰物峰面积-3Figure 4 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-3.

图5 不同提取时间下内分泌干扰物峰面积-4Figure 5 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-4.

2.5 固相提取柱净化效果及洗脱溶剂比较

对硅胶柱、C18柱和弗罗里硅土柱(Florisil小柱)进行洗脱对比实验。实验过程称取相同阴性土壤样品1 g(精确至0.000 1 g)，并加入10 mg/L的40种混合标准溶液0.1 mL，按土壤样品前处理步骤进行，得到待净化液，按照正交实验步骤，分别对硅胶柱、C18柱和弗罗里硅土柱三种固相萃取柱净化效果，以及正己烷、二氯甲烷、二氯甲烷∶丙酮(9∶1，V/V)三种洗脱溶剂洗脱效果进行正交实验分析。 结果显示无论选用哪种提取柱时，三种洗脱溶剂的总体效果皆为二氯甲烷∶丙酮(9∶1，V/V)最佳。当用二氯甲烷∶丙酮(9∶1，V/V)混合溶液作为洗脱溶剂，比较硅胶柱、C18柱和弗罗里硅土柱的净化效果，其中硅胶柱的回收率较高，基质干扰较少，净化效果最好，因此本实验采用硅胶柱净化。

2.6 标准曲线及检出限

分别对40种内分泌干扰物标准工作系列溶液(0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 mg/L)进行测定，通过内标法，以40种内分泌干扰物定量离子与内标物二(1-丁基戊烷)己二酸定量离子峰面积比y对其浓度比x进行线性回归。结果显示，在0.01～2.0 mg/L浓度范围内，所得峰面积比与浓度比的线性关系良好，线性回归方程和相关系数(R2)如表3所示。称取阴性空白样品，加入40种内分泌干扰物标准工作溶液，上机测试得出信噪比，以3倍信噪比(S/N=3)得出该方法检出限，结果如表3所示。

表3 40种内分泌干扰物线性回归方程及相关系数(R2)

2.7 方法加标回收及精密度实验

称取1 g(精确至0.000 1 g)空白样品于10 mL比色管中，按低、中、高三个水平分别加入1 mg/L的40种内分泌干扰物混合标准溶液0.02、0.1、1.0 mL，每个水平做6个平行实验，然后按照样品前处理步骤进行实验，经上机得出对应的回收率(表4)。

表4 精密度和加标回收实验结果

2.8 实际样品分析

利用本实验建立的方法，将采集来的30份土壤样品进行了检测，根据保留时间和离子比率定性，内标法定量，结果表明，在所选取的土样中，邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)与邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)等常见的邻苯二甲酸酯类均有检出(表5)。阳性样品的色谱图如图6所示。

表5 样品检测结果

图6 阳性样品总离子流色谱图Figure 6 Total ion chromatogram of positive samples.

3 结论

内分泌干扰物的测定多集中于单独测定一类物质，工作重复量大，耗时长且成本较高，应用于实际工作可行性不高。

采用超声提取方法，对土壤中的目标物质进行提取，并通过固相萃取技术将土壤中低浓度的待测组分富集和净化，通过考察不同预处理手段对环境内分泌干扰物回收率的影响，最终确定样品的最佳处理条件为：以丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶剂为提取剂，硅胶固相萃取柱为富集净化柱，二氯甲烷(90%)+丙酮(10%)混合溶剂为洗脱溶剂，建立了对土壤内分泌干扰物多种物质同时进行测定的方法，该方法操作简便快捷，前处理所需设备及试剂较少，线性相关性好，准确度高，检出限低，具有较高的实用价值，可应用于大批量的样品检测，提高环境监测效率。