外泌体与胆道闭锁肝纤维化研究进展

赵金凤，詹江华

胆道闭锁（Biliary atresia，BA）是一种威胁婴幼儿生命的纤维性炎症性疾病。北美及西欧的发病率约为1/16 000，东南亚发病率较高，约为1/9 600～1/5 300［1］。BA以肝内胆管大量增生，胆道的炎性和纤维化性闭塞为病理特点，即使早期行肝门-空肠吻合术也只能改善胆汁引流，自体肝生存状况欠佳，大多数的患儿仍会发生进行性肝纤维化,危及生命［2］。本文将从细胞因子、信号通路等方面分析外泌体与BA肝纤维化之间的关系，以期为临床干预纤维化进程，延长BA患儿自体肝生存时间提供新的方向。

1 BA肝纤维化

肝纤维化是门静脉周围区域或实质细胞外基质沉积过多，导致肝结构扭曲、功能受损、可进展为肝硬化，最终可危及生命。BA的肝纤维化机制更为复杂，而且BA患儿发生不可逆的肝脏纤维化是阻碍自体肝生存的关键。因此，许多学者不遗余力地对BA肝纤维化机制进行探索，以期望发现有效遏制纤维化进程的靶点。目前，研究发现许多调控因子及信号通路在肝纤维化中发挥至关重要的作用。其中，纤维结缔组织生长因子（vonnective tissue growth factor，CTGF/CCN2）和转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是典型的促进肝纤维化进程的关键因子，在胆道上皮细胞和肝细胞上均有表达，而且两者的早期表达均随着肝纤维化程度的加深而愈加明显［3］。此外，肝星状细胞（HSCs）的活化被认为是肝纤维化的核心，而CTGF 能通过调节HSCs的活化以促进肝纤维化的发生［4］。TGF-β1同样作为纤维化发生过程中关键的细胞因子，既能促进活化的HSCs迁移，又能介导HSCs转分化，导致迁移至门管区的HSCs释放大量基质成分,加之转分化而来的肌成纤维细胞也分泌大量细胞外基质蛋白，最终使肝纤维化进一步加重［5-6］。BA患儿肝内胆管上皮细胞会产生TGF-β2，当胆管损伤，整合素蛋白avβ6 启动TGF-β1 信号通路，使之与磷酸化的Smad2/3形成络合物，向细胞核移动，诱导细胞外基质相关基因转录，分泌胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和纤维黏连蛋白，加重细胞外基质沉积。信号通路下游分子基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）和人纤溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）过度表达，抑制了基质成分降解，加速肝纤维化进程［7］。

2 外泌体

外泌体是多泡体与质膜融合后释放到细胞外环境中，并含有特殊的蛋白质、脂质、mRNA 以及microRNA（miRNA）的纳米级囊泡，具有一定生理功能［8-9］。体外培养后形成具有胞外酶活性的细胞系脱落的微囊泡，电镜下测量其直径约为50～100 nm。直至1987年，Johnstone 等［9］将其观察到的网织红细胞分泌的微小囊泡定义为外泌体（exosome）。细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是细胞释放的囊泡的统称。外泌体是EVs中体积最小的囊泡［10］。其形成过程较为复杂，主要包含3 部分：（1）细胞外物质或细胞膜蛋白由网格蛋白介导内吞后形成胞内早期内体。（2）在细胞内逐渐成熟，形成晚期内体，在内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）的协调下以内出芽方式组装成腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），此时的晚期内体称为多泡体（multivesicular bodies，MVBs）。（3）一部分MVBs直接与溶酶体结合，被降解后排出；另一部分MVBs 与质膜融合时ILVs 被释放到细胞外，即外泌体。超速离心提取时其在1.13～1.19 g/mL蔗糖密度范围富集。在体内广泛分布于包括血液、唾液、尿液、母乳、支气管灌洗液、脑脊液、胆汁、羊水、恶性腹水等在内的体液中，其在血清中浓度约3×106/µL［10-11］。

外泌体不仅在体内分布广泛，且依靠其自身特性具有一定的功能：（1）含有大量参与细胞信号通路的蛋白，如β-连环蛋白（β-catenin）、WNT5B、Notch配体Delta-like 4（Dll4）。（2）功能性传递。体外实验证明外泌体同时包含mRNA和microRNA，可以被传递到另一个细胞，并在新的位置发生或影响转录和翻译［12］。（3）细胞间通信。由某种分泌外泌体的细胞（近端元素）、包裹了信号分子的外泌体（信使）及接收和处理信息的远端细胞3部分构成［13］。（4）免疫调节，B 淋巴细胞释放含有主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ的外泌体，能引起T 细胞反应。外泌体在肿瘤检测及组织修复方面应用前景广泛［14-16］。

3 外泌体参与BA肝纤维化的调节

近年来，随着对外泌体的研究升温，其参与调节BA 肝纤维化的功能也逐渐被关注。外泌体主要是作为细胞间信号传递的载体来调节肝纤维化进程。已知CTGF/CCN2促进肝纤维化发生。研究发现，在BA肝纤维化患儿体内，CCN2在肝细胞、胆管上皮细胞表达量也与肝纤维化程度呈正相关［3］。CCN2 的含量受转录调控因子Twist1、miRNA-214 影响。在肝实质细胞内，Twist1 驱动miRNA-214 与CCN2 的3′-非翻译区（3′-UTR）靶向结合，直接导致CCN2的mRNA 表达量下降［4］。一般情况下，静止的HSCs分泌包含miRNA-214 的外泌体，并向临近细胞传递，在靶细胞内与CCN2 的3′-UTR 结合，所以，CCN2的含量保持在正常水平，不会过度升高［17］。当肝脏组织受损诱发肝脏纤维化时，HSCs 发生活化，活化后的HSCs 可分泌包含CCN2 或CCN2 mRNA 的外泌体，通过质膜融合，CCN2 或CCN2 mRNA 向临近静止或活化的HSCs 转移，随后靶细胞中CCN2 的浓度升高，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和胶原的表达也随之增加，肝纤维化程度加重［18］。可见外泌体能通过Twist1-miRNA-214-CCN2 轴或直接传递CCN2 影响肝纤维化进程。外泌体作为一种特殊的细胞间通讯载体，能将包含特定的功能性物质通过运输、质膜融合向临近细胞转移来参与肝纤维化。

目前，BA 的病毒感染学说较为普遍，也是目前研究最多的发病原因之一。除此之外，炎症和免疫调控失调学说也备受关注。多种细胞因子均参与BA 及其肝纤维化过程。辅助性T 细胞（Treg）和Th17 细胞的发展受TGF-β1 的影响，Treg/Th17 比值越高，BA 肝纤维化程度越重［19］。TGF-β1 是肝纤维化发生过程中关键的细胞因子，Smad 蛋白家族是TGF-β超家族重要的细胞因子，TGF-β1/Smad2/3通路也是促进BA 肝纤维化发生的重要通路之一。Th17 细胞参与自身免疫性疾病、炎症反应疾病，其分泌的IL-17 诱导IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、巨噬细胞炎性蛋白（MIP）-2 等促炎细胞因子的表达，导致肝组织和胆管组织损伤。随着BA 肝纤维化的加重，Th17 细胞数量明显增加，分泌的IL-17随之增加，导致肝组织受损加重，加速纤维化进程。近来研究发现，损伤的肝细胞分泌的外泌体会激活HSCs 表面的Toll 样受体3（TLR3），进而通过增强γσ T 细胞生成大量的IL-17而加剧肝纤维化［20］。说明，外泌体不仅能作为一种信号转导载体，还能刺激炎症细胞分泌细胞因子，间接影响肝纤维化。

外泌体作为一种包含特定物质的纳米级囊泡，具有一定的生理或病理功能。近来研究发现，外泌体参与某些肝纤维化相关的信号通路。其中，Notch信号通路是一种由细胞接触介导的进化保守通路，Dll4是Notch的配体之一。Zagory等［21］提出Notch信号通路与BA 病理改变相关，当HSCs 活化时，Notch信号通路就会被激活。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）能产生含有Dll4 的外泌体，并通过质膜融合使Dll4蛋白实现细胞间转移，从而抑制Notch信号传导。此外，Notch 通路与Hedgehog（Hh）通路二者相互作用调节上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）和间充质上皮转化（mesenchymal epithelial transition，MET），阻断Notch通路会抑制Hh 通路并引起MET，阻断Hh 通路同样会抑制Notch 通路并引起MET。在发生肝硬化的动物模型中，肌成纤维细胞-肝星状细胞（MF-HSC）和胆管细胞释放含有生物活性Hh配体的外泌体，尤其在胆管结扎的小鼠血浆和胆汁中，包含Hh配体的外泌体数量明显增加［22］。这或许对我们临床阻止EMT缓解肝纤维化提供了新的思路。

外泌体不仅能通过细胞间通讯改变靶细胞的表达，而且能够影响受体细胞的活动。如：外泌体能调节HSCs的迁移［20］。肝纤维化的中心环节即为HSCs的活化，只有活化后的HSCs 才能迁移至门管区，并释放大量基质成分或者转分化为肌成纤维细胞分泌胶原蛋白，使更多HSCs活化，促进肝纤维化进程［5］。研究发现外泌体能够参与这一重要过程：当其参与调节HSCs 迁移时，首先表面的纤维粘连蛋白（FN）诱导黏附HSCs，并经过内吞进入细胞内，然后外泌体内部包含的脂酶鞘胺醇激酶1（SK1）及其产物鞘氨醇-1-磷酸（S1P）发挥作用，趋化活化的HSCs 信号转导与迁移［23］。那么，若能够阻止这些有助于HSCs迁移的外泌体生成，也就能降低门管区的基质大量沉积及更多的HSCs发生活化，也许就能有效地缓解肝纤维化进程。

4 外泌体抑制BA肝纤维化

某些干细胞来源的外泌体会通过抑制肝纤维化相关的细胞因子来抵抗肝纤维化。脂肪组织来源间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）分泌的外泌体通过抑制TGF-β1缓解肝纤维化［24］。TGF-β1 是BA 患儿发生不可逆性肝纤维化的关键细胞因子。肝脏Kuffer细胞产生TGF-β1，诱导HSCs 活化，活化的HSCs 同样产生TGF-β1 并且上调其受体，形成自体循环，刺激纤维细胞大量增殖，加速肝纤维化进程。TGF-β1启动子区域有2 个Stat3 结合位点，在HSCs 中Stat3 的激活启动了TGF-β1促纤维化，Stat3也被发现介导Bcl-2的转录，TGF-β1通过MAPK/ERK通路增加Bcl-2的表达［25］。而ADSCs 来源的外泌体通过与临近靶细胞质膜融合，发生信号传递，使HSCs中Stat3和Bcl-2的表达下调，并激活细胞自噬，抑制TGF-β1诱导的细胞纤维化基因表达，显著下调肝脏Ⅰ型胶原、波形蛋白、α-SMA和纤维粘连蛋白，那么TGF-β1信号通路下游的TIMP-1和PAI-1表达也会受抑制，最终使细胞外基质沉积明显受抑，阻止肝脏纤维化进程［24］。由此可见，未来干细胞来源的外泌体干扰纤维化进程很有前景，无论是抑制相关的细胞因子活性，还是诱导关键的细胞自噬，均有待进一步的研究探索。

外泌体能够通过干扰BA 肝纤维化发生的重要信号通路来抵抗肝纤维化。如：人脐带间充质干细胞（HUMSC）来源的外泌体能通过灭活TGF-β1/Smad2/3 信号通路，抑制肝纤维化进程［26］。肝纤维化初始阶段，TGF-β1/Smad2/3信号通路是导致细胞外基质成分增加促进肝纤维化的重要通路之一。BA 患儿肝内胆管上皮细胞表达TGF-β1 增加，Smad2蛋白在胞质与胞核之间“磷酸化与非磷酸化”转换效率升高，在胞质与胞核之间穿梭传递促纤维化信号速度加快。经胆管损伤等因素刺激后，TGFβ1 会与磷酸化的Smad2/3 形成络合物，在细胞核内启动细胞外基质蛋白等相关基因转录、促纤维化基因转录速度加快，最终促进细胞外基质蛋白生成，激活HSCs、活化肌成纤维细胞，从而促进肝纤维化进程［27］。实验发现HUMSC来源的外泌体能抑制TGFβ1、Smad2 的磷酸化及TGF-β1 诱导的EMT，导致经四氯化碳（CCl4）诱导的纤维化肝脏质地变软，显著恢复血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性，降低Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积［26］。需要注意的是，BA 肝纤维化机制较为复杂，TGF-β1/Smad2/3信号通路仅在早期纤维化进程中作用明显，随着肝纤维化程度进一步加重至肝硬化时期，该信号通路作用减弱。所以，干细胞来源的外泌体若进一步发展用于临床阻止纤维化进程时，应用时机的选择也是至关重要的。

5 小结与展望

外泌体作为一种纳米级的囊泡，内部却包含了丰富的分子信息，外吐小体（Exocarta）数据库最新数据显示，目前已确定的有9 769 种蛋白质、3 408 种mRNA 和2 838 种miRNAs，它们是其发挥新型细胞间通讯功能的重要承担者。哺乳动物几乎所有体细胞均能分泌外泌体，包括HSCs、肝细胞、胆管上皮细胞等［28］。研究发现外泌体直接或间接地影响BA肝纤维化进程，起到促进或抑制作用，对未来遏制肝纤维化进程延长BA 患儿自体肝生存时间提供一个新的方向。综上所述，外泌体通过传递特定的细胞因子、配体或miRNAs；参与肝纤维化相关的信号通路；调节HSCs的迁移等来调节BA肝纤维化。相信随着研究的不断深入，外泌体也许能够在BA肝纤维化发生、发展方面有新的突破。尤其值得注意的是，干细胞来源的外泌体更是具有治疗前景，若能据此找出遏制肝纤维化进程的有效手段，就能成功延长BA患儿自体肝生存时间。