病毒疫苗对预防胆道闭锁的可行性探讨

詹江华，余晨

胆道闭锁（biliary atresia，BA）是引起新生儿梗阻性黄疸的常见原因之一，Kasai术后进行性的炎性损伤及肝纤维化是制约患儿自体肝生存时限的主要因素。一直以来，BA的诊治是小儿外科医生面临的一大难题，关于BA 的病因、治疗以及预后的探索从未停止。明确其病因及发病机制或许可以从根源上解决问题，从而降低发病率。目前关于BA发病机制的研究主要集中于以下几个方面：病毒感染或外源性毒素、遗传易感性、免疫异常、胆道发育不成熟或胆管畸形等［1］。其中，BA围生期病毒学的研究一直是各国研究者探索的热点话题。

1 病毒与BA的关系

20 世纪70年代，美国儿科医生Benjamin Landing提出，胆总管囊肿、新生儿肝炎综合征与BA的病因学中可能存在一个共同的致病因素，并将其引申为一种嗜肝病毒的影响，而该种病毒能够作用于胆管引起结构性胆管损伤（婴儿阻塞性胆管病）［2］。近半个世纪的关于BA流行病学及实验动物学研究表明，BA致病的目标病毒主要锁定在巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、轮状病毒（Rotavirus，RV）、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）及呼肠孤病毒（Reovirus，Reo）上，围生期这些病毒的感染或许是引起BA的真正元凶［3］。

1.1 CMV 与BA CMV 感染与BA 的发生关系是迄今为止研究最多的。CMV 属疱疹病毒属的双链DNA病毒，检验发现CMV包涵体存在于胆道上皮组织中，证明CMV 可感染胆道上皮组织。2018年，国际BA 协作组基于BA 的发病率及Kasai 手术对于该病的效果制定了新的分型，该分型将BA分为伴发先天性畸形型和孤立型，其中孤立型中就包括CMV感染型，并指出该型Kasai手术效果不佳［1］。该分型的提出也从侧面反映了CMV 可以发生在BA 的围生期，持续存在并加速病情进展，应提起临床医生的关注。同时临床研究也发现，CMV感染会延迟或阻碍对BA的诊断及治疗，与未检测到病毒感染的患儿相比，CMV 检测阳性的患儿其手术日龄普遍延迟［4］。这或许提示我们CMV 感染发生在围生期并逐渐起病，而出生后早期并没有表现出症状，从而与先天型相比造成诊断时间上的延迟。

1.2 RV 与BA 虽然BA 的流行病学调查结果众说纷纭，但其可能存在的地域性和季节性差异均提示感染因素在BA发病中的作用，是对病因研究中病毒存在的有力佐证。季节及气温改变对母亲孕期和分娩的影响不可忽视，气温的降低对胎儿和新生儿生长发育的环境、暴露病毒等的作用可能成为BA发病的原因之一［5］。美国北部及日本的流行病学调查均显示，秋季（9—11月）BA 的发病率呈现一个上升的趋势，与该季节温度骤降、轮状病毒高发等因素有关［6-7］。

RV 为双链DNA 病毒，可感染肝细胞和胆道上皮细胞。到目前为止，虽然仅有少数文献报道在人体内检测到了RV感染的确切证据，但是大部分的动物实验均表明，新生小鼠感染恒河猴轮状病毒（Rhesus monkey rotavirus，RRV）后可在短期内产生BA 样表现，且与人类患病表现具有一定的重叠性，如梗阻性黄疸出现的时间、门管区胆管增生、肝纤维化、炎性细胞的激活及增多等［3］。这些征象均提示我们RV在BA发病中的作用不容小觑。

1.3 EBV/Reo 与BA 临床上多种疾病与EBV 感染均有密切关系，EBV 感染可引起机体几乎所有脏器和组织的相关疾病。虽然EBV在BA患儿中的检出率较低，但仍有学者通过显色原位杂交技术（Chromogenic in Situ Hybridization，CISH），对16例已证实的BA病例中EBV的表达进行了研究，发现在2例肝细胞和1例胆管上皮细胞中均检测到了EBV核酸的痕迹，提示病毒可在胆道上皮内渗透繁殖［8］。

Reo 属呼肠病毒科家族双链RNA 病毒，可引起胆管上皮细胞的凋亡并导致胆道的固有免疫应答，从而引起胆道的梗阻。BA 患儿肝脏中可检出该病毒颗粒，国外有研究发现，其在BA 患儿中的检出率约为32.8%～55%［9-10］。动物实验证实，幼年小鼠感染该病毒后，即便病毒被清除，但感染后在肝内、肝外胆管和肝脏实质所形成的病理学变化仍然存在，近似于婴儿BA 的改变。但关于其确切的感染机制还需更多临床数据的支持。

目前虽然还没有确切答案，但是种种迹象表明短暂的病毒接触可以引发胆管上皮细胞以及肝细胞强烈的炎症反应，以至于胆管堵塞、胆汁流动受阻、不可避免地发生肝纤维化和肝硬化。因此吸引着更多的科研人员对其进行不断探索。

2 病毒疫苗接种对BA预防的启发

据前述，病毒感染很有可能是BA发生的重要原因。因此我们是否可以从其他器官组织对上述病毒进行的预防中得到启示，进而对BA的发生发展施加一定的干预措施？根据现有的文献分析，已有通过实施疫苗接种达到了控制BA 发病率的报道。2006年，为了预防RV腹泻而将RV疫苗作为自费疫苗引入我国台湾地区，至2009年底婴儿群体中RV 疫苗的覆盖率不断增加，研究人员发现在该地区的BA注册系统中显示其发病率与之前3年相比有了明显的降低［11］。这或许可以提示我们BA是可预防的，从而找到有效的手段从根源上减少BA的发生。

2.1 CMV 疫苗 现阶段关于病毒预防的疫苗研发多集中在CMV、RV、EBV，研究较为热门的是CMV疫苗。CMV 感染是导致新生儿致畸及免疫抑制的主要原因，侵害包括消化、神经、呼吸和血液等系统。儿童感染CMV 多表现为肝脾肿大、黄疸、皮下出血等，并可引发听力、视觉等多种后遗症。从上世纪70年代就有关于人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）疫苗的研制，目前已进入第三代研发阶段，包括针对靶蛋白的亚单位疫苗以及磷酸蛋白pp65多肽疫苗等，现阶段的临床试验也表明其对于移植患者、高危人群、育龄妇女的病毒预防具有较好的效果［12］。如由重组HCMV包膜糖蛋白B（gB）/MF59佐剂组成的亚单位疫苗在产后女性中显示了50%的免疫功效；在移植患者中，（gB）/MF59和DNA 疫苗Trans Vax 限制了术后CMV 毒血症的发生［13］。这些试验的成功有望加速CMV 疫苗商品化的步伐，同时也为我们研究CMV 疫苗接种对预防BA发生带来了新的希望。

2.2 RV 疫苗 RV 疫苗是目前研究较为成熟的疫苗之一。RV是引起儿童急性腹泻的主要原因，但目前尚无特异性治疗药物，疫苗预防是较为有效的手段。目前国内已有口服RV疫苗获批进入市场，此外其对于BA的预防作用，国内外学者已经开始利用小鼠模型进行相关的探索。小鼠BA模型是用RRV感染新生小鼠并导致其发生阻塞性胆管病变，该模型为评估预防和治疗BA 的措施提供了良好的范例。研究者发现采用母体免疫接种的方式（雌性母鼠注射带有非复制轮状病毒颗粒或活的RRV 病毒颗粒），其血清RV 抗体显著升高，子代幼鼠感染RRV后不会发生胆汁淤积［14］。

此外，研究表明基于多肽的RV疫苗具有安全性高、特异性强等优点，被认为是一种较好的免疫策略选择。此前，Zheng 等［15］通过小鼠实验发现谷胱甘肽转移酶（GST）-非结构蛋白（NSP）4（157-170）和NSP4（144-152）可能是轮状病毒NSP4的细胞毒性T淋巴细胞的表位肽，通过对母鼠进行NSP4（144-152）或NSP4（157-170）的肠外免疫发现对子代新生小鼠可形成被动免疫，保护其免受RRV 感染，从而降低RRV诱导的子代BA发病率。该发现也为研制轮状病毒NSP4表位肽疫苗奠定了一定的理论基础。

2.3 EBV疫苗 儿童EBV感染发病机制复杂、临床表现多变，可参与淋巴瘤、传染性单核细胞增多症等多系统疾病的发生发展。此外，EBV感染也是BA患儿肝移植术后常见的病毒感染之一，在免疫缺陷的个体中可导致淋巴细胞增生紊乱，从而导致移植后淋巴组织增生性疾病（Post transplant lymphoproliferative disorders，PTLD）的发生，该病已成为儿童移植术后远期死亡的主要原因之一［16］。

目前EBV 疫苗的研发主要聚焦于预防性及治疗性疫苗，已有多种疫苗进入临床试验阶段，结果表明疫苗兼具良好的安全性和免疫原性。预防性疫苗主要以病毒包膜糖蛋白gp350 为靶点，刺激机体产生抗体以阻止病毒感染，用于预防传染性单核细胞增多症和PTLD 等。治疗性疫苗则以病毒核抗原和潜伏膜蛋白为治疗靶点，刺激机体产生特异性细胞免疫，增强T 细胞杀伤肿瘤的作用。国内外均已有针对鼻咽癌等肿瘤免疫治疗的疫苗进入临床试验［17］。而对于BA 而言，其与EBV 疫苗的关系不仅限于在肝移植术后对EBV 的预防，若是将疫苗接种的时间提前，甚至于在生后就进行，或许可以避免BA的发生。当然，这一设想的成功实施还有待更多流行病学资料的收集以及动物实验的佐证。

3 前景展望

诚然，上述部分病毒疫苗的研发还处于试验阶段，甚至其对BA的预防作用还只是初步的设想。但不可否认的是，疫苗的临床研究证实了病毒感染与BA 之间的关系，为降低BA 的发病提供了一个独特的视角。基于亚洲地区BA 的高发病率以及我国每年庞大的新生儿数量，若在疫苗这一关给予足够的重视和把控，相信可以降低BA的发病率甚至能从根源上解决BA的发生。