抗氧化应激研究进展

沈云辉，陈长勋

（上海中医药大学，上海201203）

氧化应激的概念源于1956年英国学者Harmna 首次提出的自由基衰老学说，该学说认为衰老是由于体内自由基攻击造成组织细胞损伤所致，自由基也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因［1］。1985年德国科学家Sies H.首次提出了氧化应激的概念。

近年的研究表明，氧化损伤不但与衰老、肿瘤相关，还与许多种其他疾病有着密切的关系，如冠心病、心衰、高血压、脑卒中、缺血／再灌注损伤等心脑血管疾病，多种免疫、炎症性疾病，糖尿病等营养代谢性疾病，慢性阻塞性肺炎、肺动脉高压等呼吸系统疾病，阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统退行性病变，肾小球性肾炎等泌尿系统疾病等。

1 抗氧化剂

氧化应激理论一经提出，对抗氧剂的研究就紧紧相随。很多研究曾表明，既然多种疾病与氧化应激损伤相关，那么使用抗氧化剂对防治这些疾病自然会有很好疗效。几十年来持此观点者一直在苦苦寻找理想的抗氧化剂，并认为这类抗氧化剂应具有以下功能。

1.1 清除体内多余自由基 氧化损伤的诱因是多余的自由基，当机体处于应激状态时，体内产生的大量自由基引起细胞和组织的氧化损伤。自由基对细胞的损伤主要表现在破坏细胞膜稳定性，激活细胞凋亡信号转导通路，诱导细胞凋亡；还会引起细胞蛋白质、糖类和脂质的变性，造成蛋白质羰基修饰、糖基化产物等。因此，理想的有效抗氧化剂应能清除自由基，并且清除自由基的能力越强越好，以制止氧化应激反应对机体组织的损害。

1.2 增强抗氧化酶活性 体内存在着内源性抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶，专门清除超氧阴离子自由基；过氧化氢酶，能通过催化过氧化氢的分解来发挥抗氧化作用；谷胱甘肽过氧化物酶，可以清除过氧化氢和脂质过氧化物。因此，设法提高这些酶的活性，加速自由基转化与失活，可使细胞免受多余自由基的损害。

2 抗氧化应激制剂研究现状

自上世纪80年代寻找有效抗氧化剂形成热点以来，研究较多的第一代抗氧化剂主要为维生素类，如维生素C、E等；第二代抗氧化剂包括β-胡萝卜素、辅酶Q10、超氧化物歧化酶等；第三代抗氧化剂广泛存在于葡萄籽、蓝莓、绿叶植物或其他中药提取物中，如花青素、番茄红素、白藜芦醇、茶多酚等多酚类物质。近年研究显示，雨生红球藻中虾青素的抗氧化活性是硫辛酸的75倍、辅酶Q10的800倍、维生素C 的6 000倍、花青素的200倍、维生素E的500～1 000倍［2］。因而，有人将之称作第四代抗氧化剂。至今还不断有新的抗过氧化物质被发掘、报道。其中有些已经作为保健品或保健品添加剂在市场营销；有些进入了临床防治疾病的实验研究。人们普遍对一个又一个出现的抗氧化剂充满期待。但可惜，至今尚无一个抗过氧化制剂被批准为临床用药。即便那些已作为保健品使用的抗氧化剂产品，对其功效的评价也常褒贬不一。

2.1 维生素E 许多基础研究认为，脂溶性的维生素E 具有抑制氧化型低密度脂蛋白LDL 生成等抗氧化作用，故对其预防心脑血管疾病功效寄予厚望。不过临床几乎没有直接证据表明其具有防治氧化损伤相关疾病的活性。Miller等［3］总结19个随机试验，参与者超过13.5万，结果该试验未能证明维生素E 补充剂有预防心血管疾病及其他生存益处作用。相反发现补充高剂量的维生素E（400～600 IU／d）可能会增加总死亡率。其结论是应该避免使用高剂量的维生素E。

2.2 维生素A、C、E 与胡萝卜素复合物 有人用Meta 分析法分析了20个随机试验（共211 818名参与者），用以评估胡萝卜素，维生素A、C、E 和硒组成的抗氧化补充剂对胃肠道癌症的发生有无显著影响。结果表明，未能发现抗氧化补充剂可以预防胃肠道癌症。相反，似乎出现增加整体死亡率的趋势［4］。同时有研究显示胡萝卜素补充对维甲酸受体表达和肺癌发生没有明显的影响。补充胡萝卜素的男性吸烟者可能由于细胞异常生长反而出现增加肺癌风险的倾向［5］。

2.3 多酚类 起源于法国的流行病学研究，与其他欧洲人相比，法国人尽管摄取几乎同样的动物脂肪，但心血管疾病的死亡率却较低。究其理由，有人推测原因之一是法国人常喝红葡萄酒。而红葡萄酒中含有的多酚成分具有抗氧化作用，能够抑制LDL 的氧化，其中典型的如白藜芦醇。白藜芦醇是存在于葡萄酒中的一种天然抗氧化剂。除葡萄皮、核之外，虎杖、桑椹等中药也含有丰富的白藜芦醇。大量的基础实验发现白藜芦醇可降低血液黏稠度，抑制血小板聚集和舒张血管，保持血液畅通，具有抗动脉粥样硬化和冠心病、缺血性心脏病、高血脂等作用［6-8］，还有抑制肿瘤、雌激素样作用等，因而认为其可用于治疗乳腺癌等疾病。基础研究还显示，除白藜芦醇外，其他多种植物，包括植物类中药以及蔬菜、茶叶、豆制品、可可豆、巧克力等食品中也含有较多不同类别的多酚类成分。基础研究显示不同结构的多酚类物质几乎都具有抗过氧化作用。但目前的临床研究尚不能表明这些多酚类物质具有防治动脉硬化作用，至于对癌症一类的疾病，同样也缺乏可供临床佐证的有力证据［9-13］。

2.4 虾青素 许多基础研究结果认为，虾青素可能是治疗心血管疾病和炎症的一种更好的抗氧化剂，但临床研究发现其对血脂和血糖的影响仍然是不确定的。Ursoniu 等［14］进行了一项荟萃分析，以评估其对血浆脂质和葡萄糖浓度的影响。此分析纳入7项符合标准的随机对照研究，280名参与者，其中163名补充虾青素，117名被分配给对照组。结果表明口服虾青素对血浆总胆固醇浓度、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯及葡萄糖均无明显影响。

3 抗氧化应激制剂临床疗效与基础研究差异的原因

基础研究表明，人体几乎所有的器官都很容易受到氧化应激带来的伤害，氧化应激与许多疾病有关。近年来科研工作者筛选并验证了许多中药及植物、藻类提取物或结构明确的单体化合物，论证了其具有确切抗氧化应激作用。但即便上述提到的，基础研究最为深入，抗氧化应激作用最强的几种提取物或单体，临床研究至今还未能证实其具有确切疗效。

3.1 体外抗氧化活性筛选方法存在的缺陷

3.1.1 总酚含有量测定 多酚类是指分子结构中有若干个酚性羟基成分的化合物总称，包括苯酚酸和黄酮类。体外实验确能观察到多酚类化合物都有一定的抗氧化能力，按照一般的逻辑推断，既然基础研究发现氧化损伤是导致许多慢性病的重要原因之一，体外实验又可以证明多酚类具有抗氧化功能，就可以推断多酚物质可以对这些慢性病有防治作用。总酚含有量多少也成了评价一些植物提取物或食品抗氧化损伤功能大小的依据。

但这种评价方式会产生误导。总酚含有量大小反映某物在体外环境抗氧化强度的大小，并不一定反映其对机体抗氧化能力大小。酚羟基属亲水性结构，某化合物酚羟基结构越多，其亲水性越强，口服一般越难吸收。如单宁就是一种植物多酚成分。可分为水解单宁和缩合单宁，低聚缩合单宁可被微血管吸收进入血液，而多聚物（超过3个单体）口服无法吸收，也就无法在体内产生抗氧化效应。低聚缩合单宁与水溶性蛋白质可结合产生沉淀，即使进入血液也可能与蛋白质结合，不一定能到达作用部位发挥抗氧化作用。

3.1.2 总黄酮含有量测定 体外实验显示黄酮类具有清除自由基作用，不同类别的黄酮还有其他多种不同生物效应。因为黄酮类具有这些作用，许多提取物或提取物制品往往以总黄酮含有量多少来标示产品的优劣。但水溶性强的黄酮体外清除自由基的能力虽强，口服却不容易吸收，大分子黄酮口服也不容易吸收。

上述单纯以体外化学测定结果判断受试物或产品的抗氧化有效性的方法显然缺少可信度，因其不能提供体内具有活性的依据。

3.2 离体器官或细胞体外研究存在的缺陷 结合器官、组织或细胞的体外研究结果较之上述不结合器官、组织或细胞的体外研究可能使人更容易相信研究结果的有效性，但实际情况大多不是如此。

3.2.1 忽视受试物浓度的合理性 有些体外研究所用活性化合物的浓度过高，不可能在整体环境实现。以白藜芦醇和虾青素为例。大鼠1次性灌服虎杖提取物10 mg／kg 后白藜芦醇的血液达峰浓度Cmax=1.93 mg／L［15］。比格犬口服给予白藜芦醇300 mg／kg，血浆浓度达峰值为4.789 μg／mL［16］。

Almeida 等［17］进行了一项白藜芦醇的健康志愿者药代动力观察，每组8人，实验周期超过48 h，其中一组受试者接受150 mg 反式白藜芦醇6次／d，共给药2 d（共13次）。第1次给药后，最大血药浓度＜20 ng／mL，最后1次给药（即第13次）后最大血药浓度只达到440 ng／mL。

有人观察了3名中年男性志愿者（37～43岁）单次摄入100 mg 虾青素后的体内动力学和分布情况，测得虾青素最高血药浓度为（1.3±0.1）μg／mL［18］。

上述研究表明，白藜芦醇、虾青素口服，不论在动物还是人体，不论单次，还是多次给予，最高血液浓度均不能达到10 μg／mL。而纵观报道用于论证白藜芦醇抗肿瘤、抗炎等作用及作用机制的体外细胞实验，可以发现为数众多的研究白藜芦醇使用浓度远超整体情况下可达到的血液浓度，因此其得出的实验结论意义有限。

白藜芦醇如此，其他化合物的类似研究情况也不少见。许多采用器官、组织或细胞的体外抗氧化损伤研究采用的抗氧化剂的浓度远远超过10 μg／mL。这类体外实验所采用的浓度实际上在活体中是不可能达到的，其所描述的体外实验结果在整体给予受试物的情况下是难以产生的。

3.2.2 体外氧化损伤模型存在的缺陷 通常制备体外细胞、组织氧化损伤模型最常用的是在培养液中加入氧化剂，主要有过氧化氢，或过氧化氢的类似物，如叔丁基过氧化氢（t-BHP），或其他可产生自由基的物质，如连二硫酸钠等。这些氧化剂在培养液中释放出自由基而造成细胞或组织标本的过氧化损伤。如果同时在培养基中加入的受试物具有清除自由基的活性就可以减少培养液中自由基的浓度，从而直接减少细胞膜上的脂质和蛋白质氧化损伤；此外，由于渗入细胞内的自由基的浓度减小，也可减少细胞内细胞器损伤。因细胞、组织标本的氧化损伤减轻或消除，从而可表现为细胞或组织MDA 生成减少，超氧化物歧化酶、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶等自由基清除酶的活性提高，细胞存活率提高，细胞结构受到保护等。但由此即认为此受试物用于人体肯定具有类似的抗氧化损伤作用则太过武断。

在生物体内线粒体是细胞供能代谢中心，90% 以上的氧分子在线粒体中被消耗［19］，细胞内通过酶反应和非酶反应产生活性氧等自由基，其中线粒体是产生自由基的主要来源，其产生的自由基和活性氧占细胞内产生量的98%左右［20］，氧作为呼吸链的终端电子受体参与产生ATP 的氧化磷酸化反应，维持生命的重要能量代谢过程；应激反应时，氧通过一系列化学反应生成有害的氧自由基，造成细胞损伤并导致疾病和衰老［21］。机体氧化应激所致自由基对生物膜系统的攻击突出反映在线粒体受损。而线粒体呼吸链的损伤又导致Ca2＋内流、氧自由基生成，形成氧化应激增强的恶性循环［22］。因此，抗氧化应激的关键是抑制或及时清除细胞内尤其是线粒体生成的过多氧自由基及缓解线粒体受损。有效的抗氧化物质不但应能通过不同的给药途径被吸收入血并分布于靶标组织细胞间隙，而且应能进入细胞内才能发挥有效抗氧化应激损伤作用。但在现有的体外氧化损伤模型体系中，只要具有清除细胞外（培养液中）自由基的化合物均可表现出减轻或消除实验细胞或组织标本氧化损伤的良好作用。但在整体情况下，那些无法进入细胞内的抗氧化剂即使体外实验的结果很好，实际也并不可能会及时清除细胞内尤其是线粒体产生的自由基，因而整体给予时并不能发挥抗氧化应激所致的组织、细胞损伤作用。

3.3 整体动物模型实验常见问题 见诸报道的整体氧化损伤实验动物模型有多种制备方法。较常见的有四氯化碳、溴代苯等化学物质引起的动物肝脂质过氧化损伤模型；D-半乳糖所致动物亚急性衰老模型和免疫功能减退模型；缺血再灌注致心、脑等组织损伤模型；四氧嘧啶或链脲佐菌素注射或联合高脂饲料喂养方法制备的糖尿病及糖尿病肾病模型；β-淀粉样蛋白海马部位注射制备的痴呆模型；内毒素引起的毒血症氧化应激损伤模型；放射线辐射引起的局部组织损伤和血象变化、免疫功能下降模型；阿霉素等药物制备的动物心肌病、肾病模型等。不能否认这些动物模型确实显现相应组织器官发生了氧化应激损伤或功能改变；也不能否认许多单味中药或中药复方提取物，或来自动、植物分离纯化后的组分或单体成分确实可显现对受损组织、器官的一定保护作用，以及同时检测到的氧化应激损伤指标的改善。但类似的研究由此得出改善这些模型组织损伤的机制在于抗氧化的结论则未免草率。

3.3.1 关联现象与因果现象混淆 不能否定过氧化损伤指标如超氧化物歧化酶活性、MDA 浓度等可以作为某些氧化损伤相关疾病严重程度的标示物。受试物如减轻了这些氧化损伤指标，表明这是疾病严重程度减轻的表现之一，但并不能说明抗氧化损伤一定是其作用机制或作用机制之一。因为目前应用于抗氧化损伤研究的常用整体动物模型几乎都不是将自由基直接注入动物某一组织器官制备的。上述制备氧化损伤动物模型的试剂或其他措施以不同形式刺激、损伤机体组织。造模措施对组织造成的原始刺激和损伤激发机体组织产生多种病理反应，也包括氧化应激反应。但当受试物对这类病理损伤显现保护作用，并同时检测到氧化损伤指标改善时，未必可确认抗氧化应激就是其作用机制。更大的可能是受试物的其他作用减轻或缓解了造模措施对机体的原始伤害，阻滞或消除了激发氧化损伤产生的条件，从而产生减轻组织氧化应激损伤的现象。

许多药物的作用是复杂的，包括维生素C、E 等作用都并不单一，更不用说中药和中药复方。但在许多研究报道中，只要研究结果显示受试物对某种组织器官有保护作用，同时呈现改善了一些过氧化损伤指标，研究者往往就会做出抗氧化应激是其作用机制或作用机制之一的结论。这样的结论缺乏可靠依据，是将关联现象认作为因果现象，并且无依据地认定了抗氧化是因，减轻组织损伤是果。其产生的后果是盲目夸大了抗氧化防治疾病的作用。

3.3.2 夸大预防给药实验结果的意义 至今并无实验证明自由基一旦造成组织损伤后使用抗氧化剂治疗还会有效。目前许多抗氧化剂整体动物实验，往往在制备模型之前或同时就开始给受试物，这种方式属预防给药试验。此类实验结果即便有效，也不能说明其具有治疗相应疾病的作用。另外，这种实验结果也说明其预防组织损伤作用机制应该是受试物的其他作用防止了造模措施对组织器官的病理伤害而制止或减轻了氧化应激的产生，而非依靠其抗氧化能力清除机体已存在的多余自由基所致。

3.3.3 忽视动物病理模型与人类疾病的差异 绝大多数动物病理模型都是根据人类疾病模拟制备的，但与人类疾病的病理机制并不完全相同。整体动物模型实验的阳性结果只是提示受试物对防治某种疾病可能有效。要证明受试物是否对人类疾病确有作用及作用机制需要临床验证。受试物的临床前整体实验是其进入临床验证的前提条件之一。受试物的临床前整体实验结果阳性，只是说明其具有防治疾病的可能性，但绝不能证明其有效性。如果整体动物实验能够替代临床有效性就无需进行临床研究了。

无视上述体内外实验的缺陷，依据一些实验轻易做出某种受试物具有抗过氧化损伤功效或抗过氧化损伤是其治疗某种疾病作用机制的结论，已经造成许多不当影响。类似研究结论过分拔高了抗氧化剂在防治疾病过程的价值，造成了使用抗氧化剂可以治疗百病的误导。

4 抗氧化剂防治疾病的价值预期

正常情况下机体的调节机制会使体内的氧化系统和抗氧化系统处于相对平衡状态。只是在内源性和（或）外源性不良刺激下，机体代谢才会异常而骤然产生大量的自由基，此时过量的自由基超出了机体抗氧化系统的清除能力，才使机体处于氧化应激状态［23］。正常量的自由基有其存在的价值。如生理正常量的自由基可以参与细胞吞噬、杀伤体内的致病微生物、杀伤癌细胞、参与激素合成、解毒以及参与氧化还原信号传递等［24］。如果预防性长期使用抗氧化剂，即便其确能进入细胞内，并在细胞内不停清除自由基，细胞内的自由基平衡系统也会促使内生性的自由基清除酶活性降低，减慢自由基清除率，或增加自由基的产生量，使自由基的浓度维持在机体的常态水平。除非所给药物不但能清除自由基，而且还能降低机体对自由基水平的调节点，其才可能产生细胞内自由基水平低于常态的结果。但至今并无证据显示已发现的抗氧化剂有此作用。如果真有可降低自由基平衡系统调节点的药物，长期使用的后果是福还是祸也很难预料。

5 展望

其实防治自由基损伤还有另一条更为可行更为方便的途径值得重视，这不同于寻找可以有效清除自由基的抗氧化剂，而是探明如何减少、制止氧化应激发生的内源性和（或）外源性不良刺激，以防止或减少超出正常生理量自由基的产生。

许多内外因素可激发机体氧化应激反应。其中物理因素包括紫外线、电离辐射；药物因素有醋氨酚、非那西汀、氯霉素、异烟肼、肼苯达嗪、阿霉素等；化学毒物有四氯化碳、除锈剂、烟雾等。香烟的烟雾除本身含大量自由基之外，烟雾还可激活肺组织中的粒细胞和巨噬细胞，使细胞释放大量活性氧自由基和羟基自由基。乙醇的代谢产物乙醛可干扰线粒体呼吸链电子传递和氧化磷酸化，通过黄嘌呤氧化酶的作用而产生超氧阴离子［24］。

因此，避免主动或被动吸烟、过量喝酒、过度运动、不当服用药物、过度日晒（紫外线辐射）等是减少引起氧化应激发生的有效措施。特别要注意的是日常生活中的进食过量也是引起氧化应激的1个主要因素。饮食过量，尤其是暴饮暴食产生的自由基可超过抗自由基系统清除自由基能力，因而也可以产生氧化应激损伤。已发现，将食物的摄入量限制在常规量的50% -70%可显著延缓大鼠衰老，延长其寿命，观察者认为其机制与减少了氧化损伤以及改善了血糖和胰岛素的调节有关［25］。

研究表明节食可能比补充抗氧化剂可可提取物对于拮抗碱基氧化更有效［26］。此外，在确保营养前提下的节食对衰老的心血管系统可产生很多有益的影响，其中一些可能与减少炎症和氧化应激有关。结合其他好处，如预防肥胖、糖尿病、高血压和癌症等，适度节食可能对人类的健康、寿命和生活质量有很大的益处［27-28］

因此，养成健康的生活方式，尽可能避免或减少日常生活中可诱发氧化应激的刺激可能较热衷于使用抗氧化剂更有利于防治氧化应激损伤相关疾病。