t-PA溶栓治疗脑卒中优化方法研究进展*

唐巍巍，熊 可，李 楠，王 爽，于亚君，晏一淇，张 晗

（天津中医药大学中医药研究院生物学部，天津 301617）

脑卒中是仅次于心肌梗死的第二大死亡病因，也是导致残疾的主要原因[1]。脑卒中分为缺血性脑卒中（IS）、蛛网膜下腔出血性脑卒中和脑出血性脑卒中3种类型，其中80%为IS。IS是一种由脑血流中断、组织缺血和神经细胞凋亡引起的疾病。糖尿病、高血压病史、心脏等原因是卒中的危险因素。中国每年脑卒中的病死率约为160万[2]，脑卒中治疗负担日趋加重。目前，组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）疗法是唯一经过美国食品药品监督管理局（FDA）认证的治疗脑卒中的方法[3]。但由于t-PA溶栓治疗的时间窗非常狭窄，并且使用t-PA溶栓后会出现脑出血、再梗死和再灌注损伤等并发症。研究发现，目前只有31%的脑卒中患者在t-PA溶栓后3～6个月后康复[4-6]。因此，想要更多的IS患者受益，就需要研究新的药物或治疗方法来减轻t-PA溶栓后产生的不良并发症或延长t-PA治疗时间窗。

1 t-PA溶栓机制及并发症产生机制

1.1 t-PA溶栓机制 正常情况下，人体内凝血和纤溶系统处于动态平衡状态，IS发生时，这种动态平衡被破坏，t-PA可调节血管内皮细胞的纤溶特性，并通过酶促反应使纤溶蛋白酶原转化为纤溶蛋白，进而使交联纤维蛋白降解[7]，达到溶栓的效果。

1.2 t-PA溶栓后并发症产生机制 脑缺血和缺血后再灌注会导致脑毛细血管功能障碍，使血脑屏障毛细血管的通透性发生改变。缺血引起的毛细血管通透性改变经历离子性水肿，血管性水肿，出血性转化3个阶段。当血脑屏障（BBB）的完整性遭到破坏，BBB不能继续维持血管内成分的稳定，水、钠离子、血液、血清蛋白等物质进入大脑，造成脑水肿，这是再灌注损伤和出血性转化（HT）的共同原因。

HT是使用t-PA溶栓疗法治疗IS后产生的最令人担忧的神经血管并发症。其发病机制是t-PA能上调和过度激活基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，溶栓后通过增加MMP-2和MMP-9活性来增加BBB损伤和缺血性脑出血症状的危险性[8]。基质金属蛋白酶（MMPs）家族由至少25个锌结合蛋白水解酶家族组成，它们消化细胞外基质（ECM），在哺乳动物的中枢神经系统中起重要的生理作用。其中MMP-2和MMP-9的表达增加可能导致缺血后潜在的神经血管的破坏、脑组织和脑细胞外基质损伤的第一阶段。MMP-2和MMP-9的过表达使EMC蛋白降解和内皮细胞的损伤，从而导致神经炎症和毒素分子进入大脑，最终造成大脑损伤。因此MMP-2和MMP-9在增加BBB膜通透性上起到关键的作用。早期的BBB损伤是导致致命的溶栓后出血的主要危险因素[9]。

t-PA引起的血脑屏障损伤通常可加速脑缺血等疾病的进程，增加细胞毒性和神经毒性的症状[4]。据文献报道，脑缺血时，BBB血管膜蛋白的降解是BBB损伤的主要原因，BBB在新的治疗方法中起到关键性的作用。因此，任何以保护BBB为中心靶点、减少t-PA溶栓后对BBB损伤的治疗方法，均可改善t-PA溶栓治疗后产生的细胞毒性、神经毒性和HT症状，并且扩大t-PA溶栓治疗的治疗时间窗[10-11]。

2 t-PA溶栓治疗优化方法研究进展

2.1 优化t-PA溶栓疗法潜在靶点 小窝蛋白-1（Caveolin-1）是小窝蛋白的主要结构，它在胞吞、囊泡运输、信号转导中起到关键的作用。Caveolin-1病理条件下会通过阻断紧密连接蛋白导致BBB损伤[12]。据文献报道[8，13]，t-PA 可以通过增加内皮细胞中Caveolin-1的表达从而提高细胞外MMP-9水平，敲除Caveolin-1后内皮细胞中MMPs的活力降低。因此，Caveolin-1可能作为IS使用t-PA溶栓后出血性并发症的治疗靶点。

t-PA+常压氧（NBO）+EtOH或低温联合使用可明显降低促凋亡蛋白的表达和促进抗凋亡蛋白表达从而来保护神经使神经存活[4]。血管生成素样蛋白4（Angptl-4）是一种分泌蛋白，它是由血管内皮细胞和心肌细胞缺氧缺血损伤产生的[14]。t-PA和Angptl-4联合使用可以减少梗死体积，改善神经功能障碍，Angptl-4可能通过防止血液不流通保护血管从而对抗急性心肌梗死，它可能成为一个新的中风治疗靶点[15-16]。

2.2 t-PA溶栓疗法风险预测 血脑屏障是一个通过严格调节分子、离子和细胞流量的动态平衡从而保护脑血管的选择性屏障。内皮细胞（EC）、细胞间紧密连接（TJ）、细胞外基质（EMC）是BBB的主要结构成分。EC可以限制跨细胞和细胞旁分子的运动。TJ和EMC是维持BBB完整性的主要组成部分。TJ蛋白主要由闭合蛋白（claudins）和闭锁蛋白（occludin）构成，形成了血脑屏障的第一道屏障[17]。EMC的主要成分为基底膜和间质充质，它的主要功能为支撑血管内皮细胞的血管组织。EC、TJ和EMC三者能够共同维持BBB内环境的稳定。Occludin是一个BBB结构中重要的紧密连接蛋白，IS时Occludin通常会遭到破坏，从而导致 BBB 损伤[12，18]。研究显示[9]，血液中Occludin蛋白水平与中风早期阶段BBB损伤程度有很大的关系：在大脑中脑动脉动阻塞（MCAO）发生前4.5 h由脑缺血引起的Occludin蛋白水平增加具有时间依赖性，4.5 h后Occludin蛋白水平急剧增加；脑缺血时，2个主要的Occludin蛋白碎片被确认。据实验证明[19]，Occludin蛋白被MMPs和Caspase-3降解成55kDa和31kDa两种，其中31kDa蛋白在血液种的水平可反应BBB损伤程度；在MCAO发生的前24 h血液中Occludin蛋白能够保持明显高于基础水平。另有研究表明[20]，由于在无出血转化的患者循环血液中Occludin蛋白水平几乎为0，所以Occludin在预测患者出血转化上好于claudin-5。由以上可见，Occludin蛋白水平可以作为临床相关的生物标记来评估使用t-PA疗法之前患者ICH风险。

2.3 t-PA溶栓疗法并发症的改善 膜联蛋白Ⅱ（Annexin A2）是plasminogen和其激动剂t-PA的细胞表面受体。在高血糖刺激7 d人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的实验中[21]，高血糖可引起Annexin A2功能障碍，从而导致整体细胞表面纤溶活性降低，当加入重组Annexin A2（r-A2）孵育后，高血糖引起的细胞表面纤溶活性降低症状可得到恢复。另有研究表明[22-23]，r-A2可减少大鼠体内颈动脉和大脑中动脉血栓的形成，由此可见Annexin A2在溶栓过程中起到重要作用。Annexin A2能与Annexin A2轻链（S100A10或P11）、plasminogen和纤维蛋白酶原激动剂t-PA形成一个四聚体[24]。与单独使用同样剂量的t-PA相比，四聚体能够使plasminogen转化为plasmin的转化率提高60多倍并且可以提高t-PA的药效[24]。与传统大剂量使用t-PA相比，r-A2联合低剂量t-PA使用可以改善局灶性栓塞脑卒中大鼠的的溶栓再灌注效应，明显促进纤溶，减少死亡率、脑梗死、出血性转变，延长中风再灌注治疗时间窗，为脑卒中的预后治疗提供了一种安全、有效的方法，同时为临床治疗的基础研究提供了理论依据[7，25-26]。

激活或抑制蛋白激酶C（PKC）同工酶被认为对缺血后的血管具有保护作用，PKCε可防止活性氧的生成和细胞内的损伤[27]。PKCα和PKCδ可使BBB的紧密连接结构和功能的完整性得到损伤[28]。PKCε通过上调claudin-5表达增强BBB的完整性，而PKCδ通过改变紧密连接蛋白定位来增加血脑屏障的通透性[29]。PKCα和PKCδ是ERK1/2分裂原激动蛋白激酶通路的初始阶段，它们可以调节MMP-9的激动。MMPs过分的激活和表达可引起内皮细胞的损伤，导致胶原、黏蛋白和层黏连蛋白基质的分裂，最终引起细胞的迁移和炎症反应的发生，大量有毒分子进入大脑[30]。苔藓抑素是一个PKC调节剂，据文献报道[31]，老年雌性大鼠在MCAO 2 h给予苔藓抑素，6 h给予r-tPA可以降低脑水肿，提高存活率。苔藓抑素可明显上调PKCε的活力，降低中风后MMP-9的表达，但不影响MMP-2的表达，减少BBB紧密连接蛋白的损伤和降低t-PA再灌注损伤后出现出血现象的风险，延长t-PA治疗时间窗促进有效安全溶栓。

西洛他唑是一个选择性磷酸二酯酶Ⅲ抑制剂、抗血小板药物，它通过增加cAMP和环鸟苷酸cGMP水平扩张血管[32]。cAMP依赖性诱导claudin-5的表达以增强脑毛细血管内皮细胞紧密连接的屏障功能。研究表明[33-34]，西洛他唑具有神经保护效应，并且可以对抗缺血性脑损伤，能够减轻MCAO再灌注的大鼠的脑梗死面积，可通过使缺血损伤最小化来改善急性缺血性中风症状。西洛他唑不仅具有神经保护功能，它还可以对抗t-PA治疗缺血后再灌注引起的出血转化。据文献报道[11]，西洛他唑与t-PA联合使用可减轻脑水肿，扩大溶栓治疗时间窗，通过降低MMP-9的活力来保护内皮细胞的损伤，通过抑制claudin-5表达的降低抑制BBB的开放，这些改变明显降低了再灌注小鼠18 h和7 d后的发病率和死亡率。另有文献报道[35]，西洛他唑与其他抗血小板药物相比能够减弱出血副作用并不增加出血时间，对所有类型中风患者二次保护的疗效优于阿司匹林，保护患者不受二次出血性中风。由此可以推测磷酸二酯酶抑制剂Ⅲ可能是潜在的治疗t-PA引起出血并发症的药物。

牛磺酸最早从牛黄中分离出来，据研究报道[36-37]，其可通过多种机制在急性缺血性脑损伤中发挥神经保护作用。例如，牛磺酸可通过抑制内质网应激和维持细胞内Ca2+稳态来下调缺血/缺氧和谷氨酸诱导的神经细胞凋亡[38]。牛磺酸还可以通过抑制NF-κB信号通路减少细胞因子和中性粒细胞的产生从而抑制脑缺血炎性反应[39]。CD147是一种基质金属蛋白酶的诱导剂，研究表明[40]，牛磺酸可通过抑制CD147依赖性MMP-9信号通路降低缺血性脑血管内皮细胞的出血性转化风险，在大鼠卒中后4 h使用牛磺酸和6 h后与t-PA联用，可以扩大t-PA的治疗时间窗至6 h，改善大鼠长期功能缺损。因此牛磺酸与t-PA联用可能成为治疗脑卒中的新型疗法。

3 结语

t-PA是目前治疗IS的一线药物，但其狭窄的时间窗和复杂的并发症限制了患者的临床获益。优化t-PA溶栓疗法有助于减少溶栓后的不良并发症，改善患者愈后症状等。其中中药治疗脑卒中具有多靶点、多途径、不良并发症少的特点，因此中药治疗脑卒中也成为了近些年的研究热点[41-42]，但是中药治疗脑卒中的机制靶点有待进一步研究。