辅助生殖技术中选择性单胚胎移植的研究进展

王明雯 综述, 童晓文, 王炎秋, 纪亚忠 审校

(1. 同济大学附属同济医院生殖医学科，上海 200065； 2. 同济大学医学院，上海 200092)

1988年3月10日我国大陆第1例试管婴儿诞生，体外受精-胚胎移植临床妊娠率从20%～30%提高至现在的40%～60%。2013年我国临床资料显示，试管婴儿临床妊娠率为40.96%，多胎妊娠率高达30.2%，2016年多胎妊娠率高达40.23%，其中移植2～3个胚胎移植周期多胎妊娠率甚至高达50.05%[1]。多胎妊娠已成为辅助生殖技术最常见的并发症，其母、婴并发症如妊娠高血压综合征[2]、胎儿宫内发育迟缓[3]、低体质量儿[4]、流产[5]、早产及胎膜早破[6]、胎先露胎位异常[7]、胎儿畸形[8]、双胎输血综合征[9]、胎盘早剥、羊水过多、羊水栓塞、宫缩乏力、产后大出血及贫血[10]等发生率均较单胎妊娠高数倍。Merritt等[11]的研究证明，ART组比自然周期组有更高的多胎妊娠率。Scholten等[12]最近研究了7个发达国家关于辅助生育技术(assited reproductive technology, ART)助孕多胎妊娠的结局，研究表明，多胎妊娠率为14.7%～29.0%，均高于自然周期组。因此，ART治疗过程中，减少多胎妊娠十分必要。本文将从以下几个方面进行综述。

1 选择性单胚胎移植(elective single embryo transfer, eSET)的优点及现状

选择性单胚胎移植主要优点是避免多胎妊娠与妊娠并发症的发生[13]。单胚胎移植(single embryo transfer, SET)组和双胚胎移植(double embryo transfer, DET)组有相似的胚胎质量和类似的临床妊娠率(44.6%vs44.7%)和活产率(34.9%vs34.2%)，而DET组的双胎妊娠率明显高于SET组(9.2%vs2.4%)[14]。SET改善了围产期的母婴结局，eSET可以降低妊娠早期自然流产率，与DET新生儿相比，eSET的新生儿出生时相对体质量普遍增加，eSET的生育期所需费用比DET低[12]。故目前国外的很多生殖中心已经开始尝试采用eSET。由于eSET的推广，2018年美国的一项研究[18]统计辅助生殖技术助孕的新生儿多胎妊娠率由2010年的46%下降到为35.3%[15]。

早在2003年，比利时为防止ART多胎妊娠制定了法律,即36岁以下首次体外受精(in vitro fertilization, IVF)时不论什么情况均行eSET;第2次IVF时原则上是行eSET,如果未得到良好的囊胚则允许行DET。比利时选择性单胚胎移植比例从1997～1998年的1.5%，上升到2007年的20%，妊娠率则达到了35%，双胎率降低至14%，较DET相比,妊娠率没有显著的下降，而双胎率显著下降[16]。2008年英国人类受精与胚胎学会(HFEA)提出了“oneat a time”项目[3]，推荐常规使用eSET辅助生殖技术。2009年，HFEA出台了政策鼓励生育中心常规采用eSET。2008年到2013年，英国多胎妊娠率降低从2008年的26.6%下降到2013年的16.3%。美国2010年eSET占所有鲜胚移植周期的5.6%，是2004年的8倍，日本的eSET比率从2007年的49.9%升至2010年的73.3%，多胎妊娠率则由3.0%降至1.3%[4]。

根据美国CDC最新统计表明，对于小于35岁的ART患者实施eSET，单胚胎移植率从3%升高至23%，能显著降低双胎妊娠率，对活产率并无明显影响[6]。目前国内尚无eSET的相关规定。目前少数采取SET的生殖中心并无一致的胚胎移植指南。

2 eSET的适应人群

卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)是ART的主要并发症。eSET既保证稳定的妊娠率，而且不增加中-重度OHSS的比例。对于年龄<35岁，卵巢储备功能正常的患者可以选择第3天优质单胚胎移植，能够获得较高的胚胎着床率和临床妊娠率,同时减少多胎妊娠率。而对于≥37岁且之前有过辅助生殖助孕失败的妇女,同时移植2～3个胚胎依然是有意义的[7]。年龄<35岁的囊胚期胚胎和平均10个以上可利用卵母细胞的患者可能是eSET的最佳人群[7]。另外，子宫畸形(单角子宫、宫颈肌能不全等)、疤痕子宫和全身并发症的患者是产科并发症高危人群，也属于eSET的适宜人群。Turner’s综合征患者常合并心脏疾病和高血压，最危险的并发症是大动脉分离，常发生于妊娠期。因此对于接受ART治疗的Turner’s综合征妇女，必须实施eSET[15]。

3 eSET的胚胎选择

3.1 单囊胚移植

囊胚培养可以有效地对胚胎进行筛选,获得比D3胚胎更好的临床结局。选择性单囊胚移植(elective single blastocyst transfer, eSBT)可以获得不输于双囊胚移植(double blastocyst transfer, DBT)的临床妊娠率且囊胚SET具有比D3胚胎有更好的临床结局。囊胚可使部分染色体异常且质量差的胚胎在体外进行自然淘汰，因此有更高的种植潜能。谭巧等[17]研究了1539个冻融胚胎移植周期，得出结论： <35岁女性移植2个冻融囊胚，双胎妊娠率高达47.6%，eSET后双胎率下降到2.7%，临床妊娠率为50%。而仅是D3单胚胎移植虽然双胎率可降到1.4%，但临床妊娠率显著下降到37.6%。

甄璟然等[8]认为，与内细胞团的评分相比，滋养细胞层质量对单囊胚的临床妊娠率有一定的预测价值。囊胚移植可能更好地筛选优质胚胎，但是囊胚培养很可能因为体外培养时间延长导致胚胎利用率降低，甚至无胚胎移植而取消周期；部分患者由于对培养囊胚成功率的担忧而拒绝囊胚培养；近年来有meta分析显示[18]囊胚移植可能会增加表观遗传改变的风险。

3.2 胚胎持续监测技术(time-lapse imaging, TLI)

TLI是在培养箱内安装内置摄像装置，对每一枚胚胎每间隔一定时间进行自动摄像。是一种用于评估胚胎质量方法的非侵入性技术。可以连续观察原核的数目和形态，运用原核和核仁的形态来评估质量，客观地反映受精卵的状态。同时提供胚胎分裂模式影像，预测囊胚形成，选择优质胚胎，改善临床结局。

TLI不需要将胚胎取出培养皿，在采集图像时可自动变换焦距，对每枚胚胎每个时间点以不同焦距采集照片，比人工观察更细致全面。在对胚胎进行观察的同时保证了胚胎稳定的生长环境，真正实现了在稳定可控的培养环境中对胚胎进行实时监测，可将所有图片合成视频并与计算机分析软件相连接，避免了传统观察方法对胚胎发育造成干扰的弊端[9]。

然而长时间的光暴露，对胚胎的损伤通常表现在： 囊胚形成率下降、DNA损伤、活性氧(ROS)生成、胚胎应激反应和诱导性凋亡等，而影响早期胚胎的发育。Sridharan等[19]研究168个受精胚胎后得出结论光照对胚胎发育速度、初次卵裂模式的影响可能与其导致细胞内PLK1生成减少有关。2016年有研究[10]指出，目前的延时摄像技术仅局限于分析囊胚形成率和胚胎着床率，对妊娠结局及其子代健康情况尚不明确。

3.3 通过卵丘-卵母细胞的微环境筛选胚胎

卵丘细胞与卵母细胞处在共同的卵泡液环境中，在排卵时以卵丘复合物的形式一起排出卵巢。卵丘细胞在卵母细胞成熟中起重要作用，若卵丘细胞和卵母细胞之间的信息传递减弱，可能会引起应激反应，改变卵丘细胞的功能，影响卵母细胞的成熟。二者在结构和功能上紧密联系，故通过卵丘细胞的转录组学分析，能够反映卵母细胞在一定时间段内对外界的各种应答。

卵丘细胞ACAA2 mRNA和ARID2 mRNA可以无创的预测胚胎发育潜能[20]。目前可以通过微阵列技术筛选卵丘细胞中与胚胎发育潜能相关的基因(HAS2、FSHR、SLC2A4、ALCAM、RGS2等)对选择性单胚胎移植有重要意义[21]。最近徐清华等[22]指出卵泡液中的GDF-9和BMP-15的mRMA含量与卵母细胞的发育潜能呈正相关，可以作为评价胚胎发育潜能的指标之一，为临床施行选择性单胚胎移植提供理论依据，积极推行单胚胎移植。Feuerstein等[23]从106例接受ART治疗的患者中收集了197例卵丘细胞(cumulus cells, CCS)，发现G蛋白调节因子2(regulator of G-protein signalling 2, RGS2)高表达卵母细胞发育潜能及临床妊娠率相关。

3.4 胚胎代谢产物的检测

胚胎的发育和代谢是一个动态过程，应用质谱分析、光谱分析和磁共振波谱技术可以客观、准确和无创的反映胚胎质量和发育潜能，提高单胚胎移植的妊娠率。不同生长潜能的胚胎在生长过程中对氨基酸的代谢情况有差异，胚胎培养液中谷氨酰胺和丙氨酸的不同水平有助于优质胚胎的选择。董梅[24]等研究，胚胎培养液中谷氨酰胺和丙氨酸水平降低，单胚胎移植妊娠率较高，具有一定的临床指导意义。培养液中适宜的氨基酸浓度(如甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸)会提高囊胚的形成率和临床妊娠率[25]。硬脂酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸也成为衡量卵子、胚胎质量的热点之一[26]。细胞因子IL-8在胚胎种植和维持妊娠方面有重要作用。Dekel等[27]研究显示，移植前人胚胎培养液中的IL-8阳性的患者有较高的妊娠率、胚胎种植率和婴儿活产数。胚胎表达可溶性人类白细胞抗原-G能避免免疫攻击，文献报道[28]胚胎上清液中的可溶性白细胞抗原-G水平可能是胚胎着床和发育潜能的重要标志,在胚胎选择过程中有重要的参考价值。

胚胎在发育过程中会自分泌一些因子，有研究表明，优质的胚胎会分泌更多的血小板活化因子,生物活性更加活跃，种植潜能更高[29]。卵泡液中的类固醇激素水平、抗苗勒管激素的水平与卵母细胞的质量和辅助生殖的妊娠结局有一定的关系。但目前没有一种代谢产物可单独作为胚胎选择的指标。

外泌体是细胞分泌的40～100nm级别膜性小泡，具有双层脂质结构高表达CD9、CD63、CD81、CD83等特异性免疫标记。细胞产生、释放外泌体于细胞外基质，外泌体运输大分子、参与细胞间信息传递，具有安全有效的靶向运输能力。外泌体存在于卵泡液中，参与调控卵母细胞的发育，影响胚胎质量。通过检测外泌体中RNA、蛋白质及细胞因子等成分，了解卵母细胞的生长发育及代谢过程[30]。2007年，mRNA和miRNA在外泌体中首次被找到[31]。胚胎质量与外泌体中的mRNA的表达数目相关。外泌体中hsa-miR-320a、hsa-miR-320b与雌二醇水平呈正相关，通过转染miR-320可以提高E2的分泌[32]。同时也在卵丘颗粒细胞中检测到高表达的hsa-miR-320a、hsa-miR-320b、hsa-miR-202-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p[33]，进一步证明在卵泡中颗粒细胞与卵泡液间通过信息传递，影响卵母细胞的生长发育。

3.5 植入前遗传学诊断/非整倍体筛查

植入前遗传学诊断需要对活检材料的遗传物质进行诊断,要求在单细胞状态下鉴别染色体或基因是否正常。植入前遗传学诊断的适应证有： 单基因性疾病、染色体病、非整倍体筛查。目前非整倍体筛查是囊胚活检，运用高通量的全套染色体分析技术,获取囊胚的滋养层细胞而不直接损伤胚胎胎儿结构。故克服了传统对极体和卵裂球活检可供材料过少、遗传学分析困难使囊胚活检后胚胎复苏存活率高。

Wathlet等[34]通过实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative PCR detecting system, QPCR)测定与卵母细胞接近的卵丘细胞的基因表达，推测胚胎的发育潜能。通过微阵列分析，QPCR等方法可以检测胚胎的整倍体性。区别于传统二代测序，目前的Micro Seq-PGD技术、等位基因映射技术，无需二次活检，对染色体断裂位点识别更为精准，但价格昂贵，难于在临床推广。但透明带开孔的激光热效应可能对胚胎造成损伤；同时延长胚胎的体外培养时间可能会增加遗传印记相关疾病的发生。且QPCR对后代健康的远期影响方面，尚未有相关报道。

3.6 胚胎蛋白质组学

蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，大规模探究蛋白质的特征与结构，在蛋白质水平上了解胚胎的发育潜能是探究蛋白质表达变化的重要工具。已经证实蛋白质表达结构、发育阶段、胚胎形态三者之间有密切联系。结合胚胎分泌的蛋白质组学与胚胎形态学进行单胚胎的选择，能改善ART妊娠结局。瘦素、同源盒基因-10、人类白细胞抗原-G、白介素-6 的高表达量均与后续的胚胎发育相关[28]。2006年，Massicotte等[35]发现E-FABP是新的母源性蛋白质，揭示了母源-胚胎转变中的蛋白质表达的变化情况。2012年，Myriam等[36]应用iTRAQ定量蛋白质组学技术筛选胚胎表达蛋白质，寻找优质胚胎的差异蛋白质。粒细胞巨噬细胞移植刺激因子加入到胚胎培养基中,能够促进哺乳动物胚胎的发育并提高移植潜能[37]。这些研究为深入了解蛋白质组学参与卵子发生、受精、早期胚胎发育等过程提供了重要的信息。

4 展 望

近年来，国内外的专家从多个层面研究单胚胎的选择。选择性单胚胎移植是一种预防性措施，可以在不降低活产率和妊娠率的前提下，改善妊娠结局。然而目前国内推广单一胚胎移植还存在一些障碍，使其在临床上推进缓慢。我国法律允许患者移植2个胚胎，同时大部分的患者对多胎的潜在风险认识也不够。为此，我们在不仅需要提高临床超排卵技术及胚胎实验室技术，精准选择单胚胎，同时还需要不断完善、扩展选择性单胚胎移植的适应证，加强对患者的宣教，推行单胚胎移植。