用卤虫与小球藻联合培养法净化养殖废水的研究

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(1.海南大学 南海海洋资源利用国家重点实验室，海南 海口 570228；2.西南交通大学 医学院，四川 成都 610031；3.广州利洋水产科技股份有限公司，广东 广州 510080；4.海南热带海洋学院 生命科学与生态学院，海南 三亚 572022)

近年来，随着人们对水产品的需求不断增加，水产养殖业得到迅速发展[1]。由于在生产过程中对于环境保护认识不够，养殖废水大多不经处理就直接排放，使得近海海区生态环境受到极大影响，赤潮频发，水体呈富营养化，水质状况总体呈恶化趋势。有研究表明，在水产养殖过程中，投放的饵料、化学品和抗生素等仅有9.0%～17.4%的能量成功传递到水产品，其余均残余在水体中，随着养殖废水的排放流入大海，直接增大了周边海域的负载[2]，对邻近海域的海水造成严重污染。目前，随着国家不断提高对环境保护的要求，生产企业传统的养殖废水处理方式已无法解决大量养殖废水排放的现状。水产养殖动物的生长发育过程需要不断摄食，将外部能量转化为自身能量，同时产生排泄物，使养殖水体内含有大量的氮磷。但水产动物又无法直接利用无机盐，氮磷含量过高时对生物具有毒害作用，导致水产养殖动物不易存活[3-4]。在此背景下，亟待找出一个对环境友好且不产生二次污染的新型养殖废水处理方法。

目前，越来越多的研究证实了大型藻与滤食性动物混处理养殖废水的可观前景[5-9]。邹俊良[10]、卢晓明等[11]和孟顺龙等[12]研究发现，底栖动物与大型藻混养处理鱼类养殖废水，氨氮去除率高达90%；卜雪峰等[13]研究表明，贝藻混养处理海水养殖废水成效显著，氨氮、总磷去除率均超过80%，可有效降低氮磷含量[14]。卤虫Artemiasalina是较为低等的甲壳类动物[15-16]，主要以水中浮游藻类、细菌和细小碎屑为食[17]，最适温度为26 ℃，卤虫富含蛋白质和脂肪酸，从无节幼体期开始就是水产品的优质活饵料，也是许多水产品幼体理想的开口饵料[18]。小球藻Chlorellavulagaris为单细胞绿藻，其生态分布广，易于培养，生长速度快，能有效降低废水中氮磷含量，达到净化水产养殖废水的效果[19]。在卤虫与小球藻联合培养净化养殖废水的研究中，卤虫前期以摄食废水自身的悬浮物为主，投放的部分小球藻成为后期卤虫的主要食物，其余未被卤虫摄食的小球藻则吸收废水中氮磷元素继续生长，两者共同结合形成绿色、可持续的处理养殖废水模式。养成的卤虫能够作为生物饵料投喂水产动物，同时养殖废水得到有效处理，甚至可以再次利用。为此，本研究中进行了卤虫与小球藻联合培养对养殖废水中悬浮物、氨磷处理效果的试验，旨在为水产养殖废水的处理开拓新途径和新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

小球藻的培养：小球藻为海南大学海洋学院藻种室保存藻种，藻类培养液为宁波三号培养液[20]，海水经高温消毒灭菌，自然光照下培养7～8 d，取指数生长期小球藻离心备用。

卤虫的孵化：在孵化培养装置里加入经高温灭菌的天然海水(盐度为35)和适量卤虫休眠卵(购自海南科品生物科技有限公司)，孵化温度为25 ℃，pH为7～8，自然光照，曝气24 h，可孵化出卤虫无节幼体。

试验用养殖废水取自海南利洋科技有限公司虾苗养殖基地。

1.2 方法

1.2.2 卤虫和小球藻联合培养净化养殖废水试验 卤虫主要以水中微藻、细菌和有机碎屑为食，养殖废水中含有大量悬浮物可供卤虫摄食。本试验中，在5000 mL烧杯中加入4000 mL养殖废水，设置不添加卤虫的空白组和添加卤虫无节幼体密度为100、200、400 ind./L的3个试验组，每组设3个平行。每天定期清理烧杯底部沉淀并换水。

(1) 卤虫摄食养殖废水中悬浮物的试验。卤虫摄食悬浮物试验时间为7 d，观察各组养殖废水中悬浮物的变化情况，如絮团状物等，定期测定养殖废水中悬浮物含量并记录数据。

(2) 卤虫与小球藻联合培养去除废水中氨氮和总磷试验。卤虫摄食悬浮物试验7 d后加入小球藻，试验共进行17 d。养殖废水中含有大量氨氮和磷元素，卤虫和小球藻在废水中生长发育，定期测定各组养殖废水中氨氮和总磷浓度变化并记录数据。

(3) 卤虫生长对比试验。试验组用养殖废水培养卤虫，对照组用无菌海水培养卤虫，两组均定量投入相同的卤虫，每天两次定时投喂小球藻，试验共进行21 d。用台微尺计算目微尺每格所代表的实际长度。每次测量时在试验组和对照组随机取10只卤虫，用鲁戈氏液染色固定后制片，在带有目微尺的光学生物显微镜(北京泰克SA3000)下测量其体长，计算各个时期卤虫体长，直至性成熟[22]。

2 结果与分析

2.1 养殖废水水体表征

养殖废水水体呈淡黄色，悬浮物颗粒肉眼可见，显微镜下可观察到大量絮团状物(图1)。经测定，养殖废水中总磷为0.27 mg/L，氨氮为0.35 mg/L，亚硝酸盐氮为2.05 mg/L，化学需氧量为3.25 mg/L，悬浮物为160.00 mg/L。对比海水水质标准，发现养殖废水中悬浮物浓度过高，不符合三类海水水质标准；养殖废水中COD符合三类海水水质标准，接近二类海水水质标准。

2.2 卤虫与小球藻联合培养下的废水净化效果

2.2.1 卤虫摄食养殖废水中悬浮物的试验结果 从图2可见：不加卤虫的空白组养殖废水中悬浮物含量在1～7 d内无显著性变化(P>0.05)；加入卤虫的3个试验组养殖废水中悬浮物含量总体呈下降趋势，各试验组1～3 d时无显著性变化(P>0.05)，第5天时200、400 ind./L卤虫试验组悬浮物含量较空白组显著下降(P<0.05)；随着3组试验组卤虫密度的增加，悬浮物浓度降低逐渐变快，第7 天时各卤虫试验组养殖废水中悬浮物含量降至最低，空白组和3个卤虫试验组的悬浮物含量均存在显著性差异(P<0.05)，但各试验组间无显著性差异(P<0.05)。

注：A为养殖废水； B为悬浮物；C为絮团状物Note:A,fresh waste water； B,suspended solid；C,flocculus under microscope图1 养殖废水水体表征Fig.1 Water apparent features

注：标有不同小写字母者表示同一时间下不同组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同Note: The means with different letters are significant differences at the same time in different densities at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia图2 卤虫与小球藻联合培养对养殖废水中悬浮物的影响Fig.2 Changes in concentration of suspended solids in aquaculture wastewater

2.2.2 卤虫与小球藻联合培养对氨氮的去除效果 从图3可见：1～7 d内各组水体中氨氮含量逐渐增高，自第5 天开始，加入卤虫的试验组与不加卤虫的空白组氨氮浓度有显著性差异(P<0.05)，各卤虫试验组间也有显著性差异(P<0.05)；第7 天时氨氮含量随各试验组卤虫密度的增多而增多，且空白组和各卤虫试验组均有显著性差异(P<0.05)。第7 天加入小球藻后，废水中氨氮含量开始呈下降趋势；第13 天时空白组与各卤虫试验组氨氮含量明显减少，试验组随卤虫密度的增加，氨氮含量减少的趋势愈加明显，空白组和卤虫试验组(200、400 ind./L)有显著性差异(P<0.05)，100 ind./L卤虫密度组氨氮含量接近空白组；第17 天时卤虫试验组与空白组、各卤虫试验组间均有显著性差异(P<0.05)，与此同时，氨氮含量降至最低，400 ind./L卤虫密度组的氨氮含量最低，为0.02 mg/L，去除效果较为明显，氨氮去除率高达93.53%。而100、200 ind./L卤虫密度组对氨氮的去除率分别为61.34%和90.72%。

图3 卤虫与小球藻联合培养对养殖废水中氨氮含量的影响Fig.3 Changes in concentration of ammonia nitrogen in aquaculture wastewater

2.2.3 卤虫与小球藻联合培养对总磷的去除效果 从图4可见：1～7 d内各组水体中总磷含量呈上升趋势；第7 天时各卤虫试验组总磷含量较高，400 ind./L卤虫密度组的总磷含量高达0.35 mg/L，不加卤虫的空白组与卤虫试验组、各卤虫试验组间均存在显著性差异(P<0.05)；加入小球藻后总磷含量呈下降趋势，第13 天时，空白组总磷含量高于卤虫试验组；第17 天时，200 ind./L卤虫组总磷含量降至最低，为0.02 mg/L，去除效果较为明显，总磷去除率高达91.39%。而100、400 ind./L卤虫密度组总磷去除率分别为78.76%和89.45%。

图4 卤虫与小球藻联合培养对养殖废水中总磷含量的影响Fig.4 Changes in concentration of total phosphorus in aquaculture wastewater

2.3 养殖废水培养下卤虫体长的变化

从图5可见：整个试验周期内，在养殖废水中虫藻联合培养的卤虫体长总体上高于在无菌海水中培养的对照组卤虫；对照组与试验组卤虫体长从第5 天开始出现显著性差异(P<0.05)；第21 天时试验组卤虫体长达6.36 mm，而对照组卤虫体长仅为4.43 mm，在养殖废水中虫藻联合培养的卤虫体长较海水对照组增长40%左右。

图5 虫藻联合培养卤虫体长的变化Fig.5 Changes in body length of brine shrimp cultured in brine shrimp-green alga co-culture medium

3 讨论

3.1 卤虫与小球藻联合培养净化养殖废水的作用机理

本研究中，试验1～7 d内卤虫通过摄食废水中的悬浮物(微藻、细菌和絮团状物等)满足自身生长发育需求，同时产生代谢物，因而导致了水体中氨氮、总磷含量增高；第7 天时悬浮物浓度降至最低，氨氮、总磷浓度也达到最高，水体所剩余的悬浮物不足以满足卤虫生长需求，第7 天加入小球藻后，一部分小球藻被卤虫摄食，未被摄食的小球藻吸收养殖污水中的氮磷后继续生长繁殖；第13天时不加卤虫的空白组和各卤虫试验组养殖废水中氨氮、总磷含量明显下降，可能是因为养殖废水中细菌和小球藻二者的生物作用消除了废水的氨氮和总磷，降低了水体中的氨氮和总磷含量，对比试验组和空白组发现，卤虫与小球藻联合培养处理氨氮和总磷效果明显，100 ind./L卤虫密度试验组与空白组氨氮密度相差无几，200、400 ind./L卤虫密度试验组与空白组氨氮密度有显著性差异，而100、200、400 ind./L卤虫密度试验组与空白组总磷含量均呈显著性差异，总体而言水体中氨氮、总磷下降趋势明显；第21 天时卤虫达性成熟时期，体长有了显著增长，表明卤虫与小球藻联合培养对污水处理效果显著。由于200 ind./L卤虫试验组摄食小球藻较少，小球藻在水体中的密度较高，提高了对总磷的利用率，故第17天时200 ind./L卤虫试验组比400 ind./L卤虫试验组总磷含量低。卜雪峰[23]、马晓娜等[24]和赖龙玉[25]用贝类和大型藻混养处理养殖废水均取得较好的生态效果，表明滤食性动物和藻类共同培养对处理废水具有一定作用[26-30]。与相关用贝、藻混养处理养殖废水的试验结果对比，本研究中卤虫和小球藻混养处理养殖废水中氨氮和总磷的效果较好，去除率高达90%以上。可能是因为试验周期较长，小球藻有更充分的时间去除水体中的氮磷，故而净化效果显著[31]。

大型藻有吸收氮磷的作用[32-34]，贝类可通过滤食作用降低水体悬浮物含量。无论是贝、藻混养处理养殖废水，还是虫、藻联合培养处理养殖废水，这两种方法在水体环境中均构成了一个微型生态系统。微型生态系统中分解者为废水中所含微生物，它通过自身生化反应将有机物降解为二氧化碳、水和磷酸盐等，并生成氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐。而作为生产者的藻类吸收二氧化碳、水和含氮磷元素的营养盐等，以阳光为能源，通过光合作用制造有机物并释放氧气，供废水中细菌及其他生物呼吸使用[35]。卤虫和贝类又以藻类为食，可控制藻类密度，益此循环，从而达到处理废水的目的。

3.2 卤虫与小球藻联合培养对养殖废水的净化效果

去除氨氮的物化处理技术中，金晓杰等[36]发现，溶胶凝胶法中氨氮去除率达85.1%，田欣欣[37]发现，吸附剂法中氨氮去除率达80%，刘永等[38]发现，臭氧发生器处理法中臭氧对氨氮催化氧化率达到50%左右。生物处理技术中，万红[39]等发现，序批式生物膜法中氨氮和总磷的去除率分别达85.1%和89.5%，王加鹏等[40]研究发现，复合垂直流人工湿地法中氨氮、总磷的平均净化效率达92.82%±3.27%、72.53%±2.31%，叶志娟等[41]发现，用海洋微藻法培养后，废水水体中氨态氮净化效率可达100%。Jones等[30]利用新型处理技术发现，自然沉淀+贝类过滤+藻类生物法中总氮及总磷的去除效率分别可达72%和86%，郭恩彦等[42]发现，臭氧+生物活性炭法中氨氮的最终去除率为96%。上述各方法所用材料、器械和人力资源较多，极大增加了生产成本。

本研究中卤虫与小球藻联合培养第17 天时，200、400 ind./L卤虫密度试验组的氨氮去除率均达到90%左右，总磷去除率则达到89%，综合养殖废水中悬浮物含量、氨氮去除率和总磷去除率三方面，200 ind./L卤虫密度试验组的效果最佳，对氨氮和总磷的去除率均高于90%。小球藻处于指数生长期且为离心后，浓度较高，进行光合作用对营养盐有更高需求，故吸收氮磷的效果较为明显。卤虫为滤食性水生动物，除了摄食废水中的悬浮物外，同时摄食小球藻以供自身生长发育。这两者相结合在废水中构成了一个微型生态系统，生产者为小球藻，消费者为卤虫，分解者为水体中的微生物，有效地促进了物质循环和能量流动，并且起到了净化废水的效果。与自然沉淀+贝类过滤+藻类生物法相比较，贝类体型较大，培养起来费时费力，且贝类的代谢物若未及时得到清理，可能会使废水中悬浮物、氨氮、总磷含量增多，使得水体富营养化，卤虫与小球藻联合培养的方法不易出现此类问题，且氨氮、总磷的去除率均高于贝、藻培养法。而新型处理技术中，郭恩彦等[42]的臭氧+生物活性炭法，所需的臭氧不易获得且价格较高，成本较大，材料几乎为一次性使用，不可循环利用和持续发展。本研究中利用卤虫与小球藻联合培养的方法处理废水，不仅有效地降低了废水中悬浮物、氨氮和总磷的含量，还极地大减少了养殖废水对环境的负担，提高了海水重复利用率。养成的卤虫还可以用于销售和作为水产品饵料继续使用，收获的小球藻不仅是鱼类、虾和贝类等幼体的优质饵料，亦可作为制备生物能源的重要材料。采用卤虫和小球藻联合培养法处理大规模水产养殖废水，下一步研究关键点为确定最适小球藻量及最适卤虫密度。

海南省水产养殖业比较发达，养殖废水处理是制约养殖业持续发展的难题。据《2016年海南省环境公报》统计，2015年海南省废水污染物氨氮排放量为2.1 万t，海水养殖废水占比较大，已经成为海南省近岸水域的主要污染源。水产养殖废水属低浓度废水，在水量上属用排水大户，每养殖1 t对虾则需用海水8.6万t。若采用传统的频繁换水的方式来改善水质，又会造成水资源的巨大浪费。因此，有关水产养殖废水的高效环保处理工艺的创新及发展是水产养殖业可持续健康发展的必要基础及有力保障。以2015年海南省废水污染物氨氮排放量为例，假如海水养殖废水在水产养殖废水占比为50%，应用卤虫与小球藻联合培养方法处理养殖废水，海水养殖废水氨氮排放量就能降低至680 t。应用该处理方式不仅能降低生产成本，还能有效降低周边海区环境负载，符合水产养殖废水的环保处理及循环利用的国家可持续发展政策，实现人与自然和谐发展。因此，卤虫与小球藻联合培养处理养殖废水应用前景广阔。