犬新鲜冰冻血浆的制备及应用

杜志国，尹 月，王 洋，高晓琦，郭 颖，尹燕博

(1.青岛农业大学动物医学院,山东 青岛 266109 ; 2.延边大学农学院，吉林 延吉 133000；3. 北部战区总医院实验动物科,辽宁 沈阳 100016 ; 4.青岛博隆实验动物有限公司,山东 青岛 266200 ; 5. 北部战区总医院输血科,辽宁 沈阳 100016)

输血疗法是输入正常血液或血液成分进行补血、止血、解毒的治疗措施，在治疗一些危重病例时具有重要作用。近年来，宠物临床上使用输血疗法的情况逐渐增加。目前，国外普遍用成分血制剂替代全血制剂，这种做法不但节约了血液资源，还降低了输血风险。成分血制剂是在一定条件下，用物理方法分离出全血内的一种或几种血液成分而制成的血液制剂。血液采集后，在规定时间内分离出的血浆，放置于-50 ℃温度以下速冻后即为新鲜冰冻血浆。犬新鲜冰冻血浆功能主要有：改善凝血能力，大幅度提高血浆蛋白浓度，治疗严重低蛋白血症、低血容量、恶病质等，补充缺少初乳的幼犬体内的免疫球蛋白IgG[1]。随着对新鲜冰冻血浆应用了解加深，目前临床上更多的用新鲜冰冻血浆治疗凝血能力缺乏，如抗凝血杀鼠剂中毒，遗传性或获得性凝血因子缺失等[2]。输注血浆的过程是有一定风险的。建立严格供血犬质量标准，特别是血传病原体检测标准，可有效控制因输血传播疾病的风险。严格按照操作规范制备、储存和运输血浆，不仅确保凝血因子和血浆蛋白不被破坏，也可有效降低输血时的不良反应。为保障犬新鲜冰冻血浆的质量与生物安全，我们参照《血站技术操作规程》[3]，从供血犬的筛选、血传病原检测、血液的采集、新鲜冰冻血浆的制备、运输等方面，开展了如下研究。

1 材料与方法

1.1 供血犬 健康状况良好的比格犬，执行了完善的免疫、驱虫程序，性格温顺，服从性强，颈静脉暴露清晰，红细胞压积不低于40%，体重10 kg以上，年龄1-8岁[1,4-6]，无输血史及血液传染病史[4,7-8]。

1.2 主要仪器 低温保存箱(-86 ℃)、血液冷藏箱(储血冰箱)、高频热合机、微电脑采液控制器(采血称)、血液分浆夹、低温低速大容量离心机、电子天平、一次性使用塑料血袋(多联袋)、血细胞分析仪、采血架等。以上仅提供采集、制备犬新鲜冰冻血浆的基本仪器，满足其采集、制备的最低要求。一些检测项目需要在专业的实验室进行检测。

1.3 采血量及采血间隔 为保障动物福利，根据相关文献[1,6,7,9]采取了适当补充营养，采血量不超过全部血量的20%，间隔21 d的方法。

1.4 病原检测 检测项目为：无形体属(Anaplasmaspp)，巴贝虫属(Babesiaspp)，巴尔通体属(Bartonellaspp)，埃立克体属(Ehrlichiaspp)，嗜血支原体(Hemoplasmas)，利什曼原虫属(Leishmaniaspp)，犬布鲁菌(Brucellacanis)[10-11]。可根据地区流行情况适当增减。

1.5 血液采集

1.5.1 采血前准备 采血前对供血犬种群的健康状况进行检查，检测血常规，抽验血传病原与某些病毒的抗体滴度，合格后方可采血；检查采血器材并核实采血耗材清单，采血环境消毒；供血犬献血前禁食(可不禁水)，剃除颈部毛发，检测体温。

1.5.2 采集血液 适当保定并安抚供血犬，使之情绪稳定。拇指按住颈部嵌窝处，即颈静脉近心端，用食指指腹触摸颈部皮肤并确定颈静脉位置、走向和粗细程度，根据触摸情况确定穿刺位点和进针路径。穿刺部位消毒后，进行静脉穿刺。如需进行2次穿刺，应在供血犬情绪稳定后，在颈部另一侧选择穿刺部位。如犬情绪紧张，出现不配合表现，应停止采血，废弃未采到规定量的血袋，按医疗废弃物管理规范集中处理。

静脉穿刺成功后，松开导管上的止流夹，使采集的血液直接进入采血称上的采血袋。血液开始流入采血袋后，固定针头位置，打开采血称摇摆开关，自动混匀血液。维持静脉穿刺点与血袋之间的落差，利用重力保持血流通畅。血流不畅时，及时调整针头位置。

1.5.3 留取样本 采血时同步留取样本，其检测结果用于判定血液能否合格。

1.5.4 血袋及血液样本标识 对同一供血犬的血袋、样本管和采血记录进行统一标识。经核对后，在采血袋、样本管、血袋导管标记同种编号，并在记录单上详细记录采血时间，供血犬耳号，血袋编号，导管编号等信息。采血袋、样本管和采血记录的标识连续完成，不得中断。血液采集后尽快保存在血液运输箱中，以待进一步处理。

1.5.5 热合 根据导管上的编号分段热合血袋导管并记录导管编号，以供交叉配血、血型复查和血液样本保存使用(见中插彩版图1)。逐一检查热合部位，如有渗漏的情况，应重新热合，并评估对血液样本无菌性的影响。热合分离采血针头，将其放置在专用的利器盒内，统一处理。

1.5.6 采血现场整理 检查采集的血液、样本及记录单信息一一对应，保证准确无误；盘点并记录物品消耗；整理废弃物，用环境消毒剂擦拭操作台及采血器材并进行环境消毒。

1.6 新鲜冰冻血浆的制备 将血袋(联袋，见中插彩版图2)放于低温大容量冷冻离心机的离心杯中，配平离心(±5 g)，离心力5 000 g，离心时间5 min。离心结束后，在离心机中取出离心杯，从离心杯中取出血袋，避免振动，进行检查，观察离心效果、血袋及其导管有无渗漏，离心杯中有无血迹，如有破损应查找渗漏点。血袋破漏的，应作消毒和报废处理[3]。

检查完成后，将血袋竖直放置于血液分浆夹中，将各导管附带的止流夹移动到连通器处并使之处于关闭状态。将空的卫星袋放置于电子称上，电子秤归零并打开相应导管的止流夹。一切准备就绪后，轻轻掰开血袋出口处的阻塞塞，此时处于血袋上层的血浆会通过导管流入空的卫星袋(见中插彩版图3)。第1次重离心后将尽可能多的血浆转移至卫星袋，在卫星袋上作与血袋相同的标识，完成后热合断离，生成1袋血浆。血浆中红细胞混入量少(目视观察)时，可继续进行下一步操作，如血浆红细胞混入量较多，应当再一次进行离心，离心完成后把上清血浆转移至其他卫星袋。

将分离的血浆编号(要与之前的编号分开并且能相互对应)并完善标签。完成后将血浆放于-80 ℃环境中速冻，注意速冻时要平铺放置，不可堆放。速冻完成后，即为新鲜冰冻血浆，可将其存放于-20 ℃以下的环境中，保质期1年，期满后可作为冰冻血浆使用，保质期在原有的基础上再加4年。整个制备过程应在血液采集后6-8 h内完成。

1.7 生物安全检测 将热合的小段导管或样本管中的血液进行血传病原检测、无菌检测。血传病原检测利用血液涂片和PCR手段，无菌检测利用血琼脂培养基培养样本进行检测。根据检测结果剔除不合格的血浆。

1.8 运输 利用厚度为35～40 mm高密度泡沫保温箱作为运输容器。通过查阅文献[12]并结合实际进行调整，运输容器内部构造从底层开始依次为：蓄冷剂、吸水纸、缓冲带、犬血浆、缓冲带、吸水纸、蓄冷剂、容器盖。冷却剂为干冰和化学冰袋，并在血浆袋之间放置适量化学冰袋。每个血浆袋都单独包装在一个封闭的塑料袋中，防止意外导致的泄露。

2 结果

2.1 采血后供血犬状态 采血709例，因供血犬挣扎，不能很好配合造成采血失败36例(5.07%，36/709)，其中因挣扎，进针方向等问题造成皮下淤血12例(5.04%，12/238)。供血犬采血后未出现明显不适症状。采血失败，皮下淤血等并未引起其他不良反应。

2.2 质量与管理 离心后出现不明原因溶血32例(4.75%，32/673)，其余均达到使用要求。血传病原、无菌检验全部为阴性。每袋血浆标识明确，均可追溯到相应供血犬。

2.3 运输安全性 通过快递、汽运等方式运输16次，试验前期出现融化现象1次，改进后未发现因运输造成的包装破损、血浆融化等现象。

2.4 临床输注结果 临床输注新鲜冰冻血浆1 197例，医师反馈使用效果良好。除个别表现为体温略微升高外，未发现其他不良症状。在本单位输注新鲜冰冻血浆55例，用于严重脱水、凝血因子缺乏及重危病例，病犬康复效果明显。其中3例出现单纯发热症状，治疗后恢复正常；1例为突发性四肢僵直，停止输注后症状消失；过敏反应2例，表现为脸部肿胀，体温升高，抗过敏治疗后症状消失，未见其他不良反应。

3 讨论

Bernard F.Feldman、Jenny Helm、R.L.Lucas认为供血犬体重应为22.6～25 kg以上[1,5-6]，国内张海斌、梁永春提出供血犬体重应为10～20 kg[13-14]。我们通过比格犬的采血试验发现，10 kg以上的比格犬完全可以承担供血犬的任务。目前经国际标准确定的血型为8种，每个血型采用“DEA+数字”方法进行命名[15-16]。DEA1.1和DEA1.2是DEA1血型的两个亚型，抗原性最强，分布广泛，是引发急性溶血性输血反应的主要原因。目前DEA1血型的检测手段已十分成熟，但其他血型的快速检测手段仍然处于开发阶段。根据现有条件，将供血犬血型分为DEA1阴性与阳性两类。由于犬体内不存在DEA1.1、DEA1.2、DEA4和DEA6的天然抗体[17]，如果仅是制备血浆的情况下，可以不对供血犬进行血型检查。如果随血浆同步制备红细胞悬液，则必须检测供血犬血型。为了减少病原体的传播，所有采集的血液都应进行血传病原检测。供血犬采血前进行的血传病原检测结果不能代替相应血液制剂中的血传病原检测。

建立严格供血犬质量标准，按照操作规范制备、储存和运输犬新鲜冰冻血浆，是保障其质量与生物安全的基础。我们通过参考人类血站的操作规程，并经多次实践得出了适用于宠物临床的操作流程。在犬新鲜冰冻血浆的制备、储存、运输、追溯性与生物安全性等方面，已趋于成熟，形成了自己的规范。但仍存在不足，如供血犬的保定与安抚问题、血传病原的检测手段仍未达到国外先进水平等。

通过大量临床输注，发现本方法制备的新鲜冰冻血浆安全性高，疗效显著。虽有少量病例发生输血反应，但症状轻微，及时发现，对症治疗后，输血反应均很快消失，临床未发现其他损害。上述结果证明，我们建立的工艺流程、技术标准是可行的，设施、设备及工作环境是可靠的，产品的储存、运输方式也经得起实践的检验，这些工作为建立专业动物血站提供了参考。