动物病毒多表位疫苗的研究设计与应用分析

覃一峰，薛 佳，张国中

(中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193)

疫苗泛指具有抗原性，接种机体后能够产生特异性免疫力，并可抵御其针对传染病的发生或流行的生物学制剂[1]。目前，临床上使用的畜禽病毒病疫苗主要是弱毒苗和灭活苗。弱毒苗在临床应用中可能会存在毒株返强以及疫苗株与野生型毒株基因重组等安全性问题[2-3]。而灭活苗更倾向于诱导体液免疫，其诱导细胞免疫的能力相对较弱[4-5]。一个理想的疫苗除应具有安全性之外，还应同时诱导机体的特异性体液免疫和细胞免疫。通过诱导体液免疫产生高亲和力中和抗体，阻止病毒与靶细胞受体的结合。而诱导细胞免疫则产生特异性细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)，CTL识别靶细胞后能够直接裂解靶细胞或者诱导靶细胞的凋亡[6-7]，从而抑制病毒在体内的复制。

多表位疫苗是近年发展起来的一种基于目标抗原表位设计的新型疫苗，相对于传统弱毒疫苗，其安全性更高[8]。将病毒蛋白上的多个B细胞或T细胞表位整合到特定载体上构建的多表位疫苗能够有效刺激机体产生针对多个表位的B细胞或T细胞克隆，从而有利于控制病毒的感染。多表位疫苗在抑制病毒复制和对抗免疫逃逸株等方面都具有独特优势[9-10]，是目前疫苗研究的一个热点。本文就多表位疫苗的构建策略及动物病毒多表位疫苗研究进展作简单综述，为了解该类型疫苗在动物疫病防控中的应用潜力奠定基础。

1 表位的研究

表位又称抗原决定簇，是存在于病毒蛋白上能与相应淋巴细胞受体结合的一段短的氨基酸序列。按照其结合淋巴细胞受体类型的不同，主要分为B细胞表位和T细胞表位两大类[11]。

1.1 B细胞表位 B细胞表位是指能被B细胞受体(B cell receptor,BCR)识别的一段氨基酸序列，根据构型不同可以分为线性表位和构象表位。B细胞线性表位是连续的氨基酸序列，而构象表位的氨基酸不连续延伸，通过蛋白质折叠在空间上聚集在一起[11]。目前对B细胞表位的研究主要集中于线性表位，构象表位的研究相对滞后，主要是因为构象表位的研究技术相对较为复杂。目前研究B细胞表位的技术主要包括表位预测、化学“切割”法、肽探针扫描技术和噬菌体随机肽库法等几种。沈友林等[12]通过表位预测结合间接ELISA方法在I型鸭甲肝病毒(DHAV-1)的VP3蛋白上鉴定出2个线性B细胞表位。周国辉等[13]利用单克隆抗体结合噬菌体展示技术在A型口蹄疫病毒的VP1蛋白上鉴定一个构象中和表位。韩宗玺等[14]通过噬菌体随机肽库法和肽扫描技术在禽传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白上鉴定出2个保守的B细胞线性表位。鉴定的B细胞表位为开发畜禽诊断试剂和多表位疫苗奠定了基础。

1.2 T细胞表位 T细胞表位是供T细胞受体(T cell receptor,TCR)识别的一段短氨基酸序列，与B细胞表位不同的是，T细胞表位都是线性表位，而且具有MHC(Major Histocompatibility Complex,MHC)限制性，即它们必须与特定MHC分子结合后才能被对应的T细胞识别，从而刺激T细胞的增殖与分化[11]。根据识别T细胞种类的不同，T细胞表位又分为CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位。CD8+T细胞表位与MHC I分子结合，MHC I分子两端封闭，主要结合长度为8～11氨基酸(AA)的肽段[15-16]。CD4+T细胞表位与MHC II分子结合，由于MHC II类分子的两端不封闭，所以其结合的肽段长度不受严格限制[17]。随着不同种类动物MHC分子结合基序的解析，越来越多的动物病毒T细胞表位被鉴定。丁铲等[18]通过已知的鸡MHC I分子结合基序在禽传染性支气管炎病毒S1蛋白上预测出21个T细胞表位，并通过酶联免疫斑点技术(ELISpot)和T细胞增殖试验鉴定出4个CD8+T细胞表位。Reemers等[19]在H7N1的NP和M1蛋白上预测33个T细胞表位，通过ELISpot鉴定16个为功能性CTL表位。Bai等[20]通过在牛白血病病毒的env，gag和tax蛋白上合成一系列重叠多肽，利用WST-8细胞增殖试验和乳酸脱氢酶(LDH)释放试验鉴定11个CD8+T细胞表位，并认为env蛋白上的gp30是研究牛白血病病毒疫苗的最佳候选区域。

2 多表位疫苗的构建策略

2.1 多表位疫苗的设计 由于单个表位只是一段短的氨基酸多肽，分子量较小，很容易被降解，同时其免疫原性也较差。因此在实际应用中一般需要将它们进行合理设计才能更好地发挥作用。目前表位疫苗的设计主要包括脂肽模式、空间伸展模式和线性串联设计三种方式[17]。其中，脂肽模式是将含抗原表位的多肽共价连接到脂质分子上构建的脂肽疫苗，该类型疫苗利用脂质分子的高亲脂性将多肽导入细胞内，能够有效激发机体的细胞免疫[21]；空间伸展模式是将多个抗原表位与分枝状多聚赖氨酸核心骨架偶联，构成多聚抗原肽，利用该方式可提高抗原表位的稳定性和免疫原性[22]；而线性串联设计是将多个抗原表位按照一定的顺序串联起来，并将串联的多肽链连接到特定载体上构建出的表位疫苗，该方法最直接，且能有效避免单个表位易降解和免疫原性较差等缺点，所以其在多表位疫苗的设计中应用相对最为广泛。

2.2 多表位疫苗的优化 构建串联表位时在表位间引入一定的间隔序列可以提高表位疫苗的蛋白酶水解和抗原递呈效率，同时避免在相邻表位间引入新的连接表位。Livingston等[23]在构建CD4+T淋巴细胞多表位疫苗时发现，若将表位按顺序首尾相连时，会在表位连接处引入新的与MHC II分子结合的连接表位。若在相邻表位间引入GPGPG间隔序列，能够明显提高表位的免疫原性。刘祖强等[24]分别构建包含GSGGGGS、GS和RS三种不同表位间隔序列的免疫原，研究结果表明，表位间隔序列对免疫原刺激机体产生表位特异性抗体有着显著影响。除此之外，表位的侧链残基对于精确处理表位也十分重要，一些研究认为，侧链含有丙氨酸的表位可以提高T细胞的表位处理和识别能力[15,25-26]。Cole等[27]发现通过修饰流感病毒血凝素表位(HA305-320)C末端肽侧翼区域可以改变其与T细胞受体结合的亲和力，进而影响T细胞的激活。在多表位疫苗的设计过程中，还可以通过表位重复策略提高特异性免疫应答。刘祖强等[24]研究发现，在诱导抗体水平方面，八重复表位明显优于四重复表位，更优于单表位，说明在重组蛋白中增加表位的重复次数可以明显提高表位的特异性抗体应答。

3 多表位疫苗在畜禽病毒病防控中的应用潜力

多表位疫苗作为一种新型疫苗，近年来在畜禽病毒病中的研究较为广泛，尤其是一些对养殖业危害严重且基因变异较大的病毒病。邵军军等[28]通过将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白上的141-160AA和200-213AA两个表位重复3次，并连接到猪免疫球蛋白G重链恒定区构建多表位重组疫苗，免疫猪群后诱导高滴度的FMDV中和抗体，达到甚至超过OIE的推荐值，同时诱导高比例的淋巴细胞增殖，完全保护猪群抵抗同源病毒感染。成子强等[29]将4个在禽白血病病毒(ALV-J)分离株中普遍存在的变异表位克隆到pET-32a (+)载体上，通过原核表达获得多表位蛋白抗原，将其免疫鸡群后获得高滴度抗体，能够识别并中和不同的ALV-J毒株，且能免疫期至少维持126 d，免疫鸡群获得对抵抗ALV-J感染100%的保护率。彭金美等[30]以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NA基因及其表位为基础构建多表位DNA疫苗，免疫鸡群后血清HI效价和外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞都有不同程度的升高，并在高致病性禽流感病毒H5N1攻击时对鸡群提供一定程度的保护。谭磊等[31]将禽传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白上的4个CD8+T细胞表位和3个B细胞中和表位通过柔性肽(G4S)连接构建多表位DNA疫苗，免疫鸡群后产生与表达完整S1蛋白免疫组相同的中和抗体水平，但是其诱导的细胞毒性T细胞反应明显高于表达完整S1蛋白的免疫组。在同源病毒攻击时完全保护鸡群，并能更有效地降低鸡群排毒和维持气管纤毛活性，说明细胞免疫在抵抗IBV感染中起重要作用。

4 展望

虽然近年来多表位疫苗的研究已经取得了较大进步，但是目前还存在一些问题需要解决，主要是：(1)目前对B细胞表位的研究主要集中在线性表位，而对构象表位的研究相对较少，这可能会错过部分中和表位，导致疫苗的效力降低；(2)相对于人类，目前对动物MHC分子的研究较为滞后，这会阻碍动物病毒T细胞表位的鉴定以及设计覆盖面更广的通用型多表位疫苗；(3)通过生物信息学预测表位的准确率还不够高，可能会漏掉一些主要抗原决定簇，提高表位预测技术将会在一定程度上降低表位疫苗的开发成本；(4)如何提高表位肽的免疫原性也是研究的热点，对于串联表位疫苗来说，目前的研究主要集中在提高表位蛋白的表达水平、表位的处理和递呈效率和添加免疫刺激因子等方面。多表位疫苗作为一种新型疫苗，一经问世即成为免疫学研究领域的热点，相信随着更多MHC分子结构的解析以及生物信息学的发展，会有更多有效的多表位疫苗被开发，在抵抗人类和动物病毒感染中发挥更大作用。

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