细菌纤维素发酵生产的研究进展

刘 畅，薛静雯

(1.南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 211111；2.南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210023)

细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是由不同微生物合成的纤维素总称，为一种多孔网状的纳米级生物高分子聚合物。我国早在《齐民要术》就有记载食醋酿造过程中会在表面形成凝胶状菌膜。后于1976年，英国科学家Brown在静置培养木醋杆菌(Acetobacterxylinum，现名葡糖醋杆菌Glucoacetobacterxylinum)时，其表面形成一层白色凝胶状薄膜，经物化分析确定该膜为纤维素类物质，而后对该物质进行水解，得到的主要成分为葡萄糖[1]。BC是多酶复合体系(纤维素合成酶，Cellulose synthase，CS)精确调控下的产物，仅由β-1，4-吡喃葡萄糖单体聚合的直链多糖，因此纯度极高[2]。比起植物纤维素，BC还具有“上疏下密”状三维网络结构、高机械强度、高吸水率、高锁水率、良好的生物相容性等特性，因此被广泛应用于医学、纺织、食品、细胞培养等多个领域[3-9]。BC应用前景十分广阔，但目前BC发酵生产成本较高、产量略低，其产品的附加值低，故更大范围的市场推广受到了一定的制约。因此本文简要论述了BC发酵生产的影响因素，为研究者们提供一些从菌种、发酵原料、发酵条件三方面对发酵工艺进一步优化的可能性，以期扩大BC发酵生产规模并提高产量。

1 菌种选育

从源头筛选高产且稳定的菌株，对优化BC发酵生产有直接效果。当前产BC菌株主要包括醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、产碱杆菌属(Alcaligcncs)、八叠球菌属(Sarcina)等，其中比较典型的是醋酸菌属中的木醋杆菌，亦是迄今研究最为透彻的产纤维素菌。木醋杆菌是革兰氏阴性菌，长1.0～4.0 μm，宽0.6～0.8 μm，常以单个、成对或链状存在[12]。木醋杆菌在生长过程中可以利用多种底物，当菌体受到物理或化学损伤时，纤维素会对细胞起到一定的保护作用，因此木醋杆菌也是目前已知的菌株中产纤维素能力最强的。

产BC菌株可从发酵的饮品、腐烂的水果中被分离出来[13]，经过富集培养、初筛、复筛得到单一菌株。关于BC高产菌株的选育，很多学者运用自然选育、诱变育种、基因工程等方法进行了大量的工作。贾士儒等通过自然选育得到葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacteroxydans)B-2菌株，将BC产量提高到2 g/L[14]。马承铸等从150份自然材料分离出26株产纤维素菌株，自然选育后得到Ax-Ⅰ、Ac-Ⅱ两株高产菌株，在50 g/L蔗糖(或葡萄糖)培养液条件下分别可产14 g/L、16 g/L纤维素[15]。余晓斌通过紫外诱变成选育BC高产菌株，将BC产量由6 g/L提高到10 g/L[16]。杨甲平对J2菌株进行超高压处理得到诱变株M438，在相同发酵条件下M438的BC产量达到了15.7457 g/100 ml，是原菌株J2(10.76 g/100 ml)的1.485倍[17]。Carolina等克隆了(Gluconacetobacterhansenii) ATCC 23769 CS操纵子中的部分基因来探究在菌株中过表达这些基因对BC产量的影响，尽管结果尚不明确，但为日后的研究提供了一些新的思路[18-19]。Tonouchi等在木醋杆菌中表达了肠膜明串株菌(Leuconosocmesenteroides)的蔗糖磷酸酶(EC 2.4.1.7)基因，使木醋杆菌能更好的利用蔗糖，从而提高纤维素的产量[20]。在利用各种方法得到高产BC菌株后，还要对菌株进行遗传稳定性检测，保证在传代后目标性状依然存在且不存在其他突变，完成检测后斜面保存菌种。

2 发酵原料

产BC菌株为异养型，故在其生长过程中需添加能源物质。目前发酵产BC菌株常用的是HS培养基，由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏以及一些有机酸和无机盐构成，HS培养基的BC产量为约1.757 g/L。Ramana在培养菌株时添加不同的培养基组分，发现不同的添加物对BC产量的影响不尽相同[19]。

2.1 碳源

BC发酵培养基碳源成分主要有葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、乳糖等。李珏等人在动态培养葡糖酸醋杆菌JR-02过程中，发现当碳源质量浓度为20 g/L时，果糖作为碳源的培养基中BC产量最高，其次是葡萄糖、甘露糖，而二糖作为碳源时BC产量明显降低[21]。夏文等在此基础上发现果糖作为碳源时BC产量高，是由于菌体中焦磷酸化酶和磷酸葡糖异构酶活性较高，依赖于磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸转移酶系统可将D-果糖转化为1-磷酸果糖，经两步异构后变为6-磷酸葡糖，最终形成纤维素[22]。Ramana比较了甘露醇和葡萄糖对BC产量的影响，结果显示添加甘露醇的培养基BC产量明显高于添加葡萄糖的产量，因为甘露醇在菌体次级代谢中不会转化为葡糖酸，能使菌体环境pH更加稳定。赵琼进一步探究了不同含量的甘露醇对BC产量的影响，发现添加10%的甘露醇BC产量最大[12]。此外，用混合糖做碳源也能提高BC产量。马霞发酵时分别以20 g/L的葡萄糖、果糖、蔗糖以及它们的两两混合物为碳源，其中以葡萄糖、果糖为碳源的BC产量分别为2.1 g/L、1.8 g/L，而以葡萄糖与果糖混合物为碳源的产量达到了2.55 g/L[22]。Premjet在不含葡萄糖的HS培养基中添加2.45%蔗糖和0.7%果糖，最终BC产量是HS标准培养基的179%[22]。混合糖能促进多种糖代谢，使己糖磷酸能更多的用于合成纤维素，因此混合糖做碳源能够提高BC产量。根据研究结果，果糖和甘露糖是大部分菌株的良好碳源，但这种纯度高的碳源也相对昂贵，小型发酵或是实验研究时建议选用这两种为碳源，大规模工业化生产还是选用葡萄糖为宜。

2.2 氮源

用于BC生产的氮源物质主要有蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、玉米浆干粉、豆饼粉等。李珏在研究相同浓度(5 g/L)的不同氮源对BC产量的影响时，发现以玉米浆干粉为唯一氮源的培养基中BC产量最高(2.09 g/L)[22]。Jung等利用玉米浆为氮源生产BC，结果显示与HS培养基相比BC产量从1.53 g/L提高到了3.12 g/L[25]。据报道玉米浆中的乳酸可转化为丙酮酸并产生能量，丙酮酸可刺激三羧酸循环进而提高纤维素产量，此外玉米浆还可以帮助稳定菌体环境的pH，并且相较于蛋白胨、酵母膏等氮源，玉米浆在价格上更具优势[18]。李飞等用玉米浆作氮源时BC产量达到9.2 g/L，但其成本只是对照组的15%[26]。除玉米浆外，赵琼还以其他不同氮源进行发酵，结果大豆蛋白胨为氮源的产量最高，其次是牛肉膏和酵母膏，而以(NH4)2SO4、NH4Cl、KNO3这三种无机盐为氮源的培养基中检测不到任何纤维素[12]。此外，有研究指出以不同混合物为氮源，BC最终产量也呈现差异。程建军在氮源总质量浓度为25g/L的条件下，将有机氮源蛋白胨和酵母浸粉等量混合后BC产量最大，达(4.22±0.08) g/L，显著高于添加其它几种氮源[27]。迄今对混合氮源的影响研究尚浅，需要更多的工作来确定最佳氮源混合物。根据当前的研究进展，玉米浆和蛋白胨是BC发酵的优良氮源，作为工业化生产更推荐价格低廉的玉米浆。

2.3 添加物

在培养基中添加一些除碳源、氮源外的物质，对保证发酵的持续高效进行有不可忽视的作用，这类物质主要是无机盐如钾盐、磷盐、钠盐和有机酸如醋酸、乳酸、柠檬酸、丙酮酸等，某些菌种还可选择性的加入低聚糖、维生素、醇类等物质。大部分添加物的作用机理是增加培养基粘度从而降低剪切力的作用，或是抑制葡糖酸的形成，亦或是改变细胞状态，最终达到提高产量的目的。李珏等人在培养基中添加低浓度的Na2HPO4、MgSO4、CaCO3，结果BC产量都不同程度的提高[18]。Mg2+和Ca2+是菌类生长的所需元素，可作为多种酶的辅基或激活剂，故添加适量浓度Mg2+和Ca2+可促进BC生产。Na2HPO4能够对培养基pH起缓冲作用，因此提高BC产量，但是添加低浓度的KH2PO4对BC合成没有显著影响，当KH2PO4达到一定浓度后反而会对BC合成产生抑制作用[27]。Song在基础培养基中加入0.4%的琼脂，最终BC产量提高了10%[22]。维生素C与BC间的亲和力较高，Kesh在HS培养基中加入维生素C，最终BC产量提高而结晶度下降了[22]。此外还有多篇文献报道乙醇对大部分合成纤维素的菌株都有增产效应，这种增产效应是由于大部分菌株能将乙醇转化为乙酸，进而转化为二氧化碳和水，以此提高ATP的水平，促进纤维素合成。Takaaki等在研究中发现加入浓度低于15 g/L的乙醇可以提高BC合成速率和总产量，但是超出这个量便会抑制BC合成[28]。但是不同菌株对乙醇的这种增产效应呈现出差异性反应，如木醋杆菌NLQ127就不同于大多数菌株，乙醇对NLQ127菌株不存在增产效应[28]，所以不同的菌株都需要测试其对乙醇的敏感性和耐受性，明确该菌株是否适宜添加乙醇，如果适合再确定最佳浓度。还有研究者添加榴莲壳水解产物[29]、酿酒厂污水[30]、多糖发酵废水[31]等物质用以发酵产BC菌株，最终前两者的BC产量都显著提高了，分别达到2.67 g/L、8.5 g/L，而多糖发酵废水中的BC产量下降到了1.177 g/L。

不同发酵原料对不同菌种会产生差异性影响，因此建议在正式发酵生产前先进行小型发酵试验，确定最佳添加物及其最适浓度，综合考量增产效益和经济效益后确定发酵原料。

3 发酵条件

3.1 pH

pH会改变细胞膜的电荷以及菌体环境的离子强度，进而影响BC的产量和形态。Satoshi等对初始pH为2.5～7.7间的不同培养基的BC产量进行比较，发现当pH为4.0～6.0时BC产量明显高于其他pH值下的产量[25]。赵琼研究木醋杆菌突变株C544时，发现pH为6.0时纤维素产量最高，而当pH低于5.0或超过7.5时产量就极小，达到8.5后就没有纤维素产生了[12]。Jagannath等以椰子水为原料静态发酵菌株，当初始pH为3.5时培养20d也无明显BC膜出现，而初始pH为4.0时，短时间内就可以观察到明显的BC膜。王雪奇等从黄酒和红茶菌中筛选得到两株产BC菌株，分别在最适pH(4～5、5～6)下培养BC产量分别达到了2.0和1.7 g/L[34]。除了考虑初始pH对产量的影响，还要培养基组分在发酵过程中对pH的影响，例如用椰子水发酵的培养基pH变化就比较小，因为椰子水缓冲容量大，而用其他浆水发酵的pH变化幅度就相对大一些[35]。又如以葡萄糖为碳源时，菌体会将葡萄糖转化为葡糖酸，造成发酵环境的pH降低，从而BC产量减少，若是加入乙酸可以减弱这种转化能力，更有利于BC合成。综上来看，BC发酵生产的初始pH在6.0左右最为适宜，但还要考虑培养基组分在发酵过程中对pH的影响，pH越稳定的培养基组分越适于发酵。

3.2 温度

温度会影响菌体的生长发育和代谢物生成。Fontnaa等人比较了发酵温度为22～34℃间醋酸杆菌BC的产量，发现在此温度范围内产量随温度上升而提高，但超过34℃菌株就无法正常生长，更无法形成BC[27]。赵琼在研究木醋杆菌突变株C544时结果显示该突变株在25～31℃生长旺盛，30℃时产量最高为2.21 g/L，超过32℃ BC产量骤降，此外他还发现C544有一定的耐低温性，在19℃时还可以产BC[12]。朱宏阳等动态培养时发现当温度为32℃时BC产量最高，并且此时产生的BC颗粒直径和均匀度最佳[36]。大部分菌株的最适温度都为28～30℃，超过30℃时BC产量便开始下降，因此BC发酵生产中常选用30℃为最适温度。

3.3 接种量

接种量会影响菌种在发酵过程中的生长速度，适宜的接种量范围内菌株能快速生长，代谢产物也会快速合成，并且菌株生长速度随接种量的增加而提高，超过适宜范围后菌株就会因生长速度过快而减少BC合成。汤卫华等以硅胶管为发酵容器，分别接种2%、4%、6%、8%(v/v)的木葡糖醋酸杆菌(Gluconacetobacterxylinum)，在30℃下培养6 d后发现接种量为4%(v/v)的硅胶管中的BC产量最高[37]。许燕娜等采用HMF培养基对木醋杆菌CGMCC5173菌株进行实验，结果表明当接种量为10%时BC产量最高，达到了14.79 g/L[38]。朱宏阳等对解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)ZF7菌株进行接种量测试，发现当接种量为5%时BC产量最高，接种量在9%以下时BC颗粒和直径呈现比较均匀[36]。不同菌株以及不同的培养基组分都影响最适接种量，大部分菌株都适用于5%的接种量，通过预实验可以更精准的确定最适接种量。

3.4 发酵时间

不同的发酵时间可以显著影响BC合成情况，如产量和颗粒形态。通常的发酵情况下当发酵时间不断延长，纤维素会逐渐由短丝状变为细团状，5 d后BC颗粒趋于稳定，此时检测培养基成分可以检测到葡萄糖基本耗完[38]。观察菌株的动力曲线可以发现，一般发酵2 d后进入对数生长期，7 d进入稳定期，此后BC产量趋于平缓。此外，王艳梅等在用椰子水进行预发酵实验时发现进行预发酵1～2 d能显著提高BC产量[39]。所以在BC发酵生产中可以尝试先进行两天预发酵，再正常发酵5～7d，这样BC产量可达到最大化。

3.5 转速

在进行动态培养时，摇床转速也是一大影响因素。朱宏阳等人对比了静态培养和不同转速下动态培养的BC产量，发现当转速到达200 r/min时，BC就更容易与絮状物形成颗粒团，200 r/min以下时转速越大BC颗粒就越大且数量越多。研究表明小瓶动态培养下BC产量普遍低于比静态培养下的产量，因为动态培养时氧气充足但能源物质得不到补充，菌体生长旺盛呼吸作用强烈，同时碳源消耗较多，从而减少了BC合成[36]。李珏等指出当转速取160 r/min时，大部分菌种能达到最高产量，但随着转速的进一步提升，BC产量反而会下降，因为高转速会提高剪切力破环纤维素的合成[18]。因此动态培养时转速取160～200 r/min为宜，具体可视发酵装置大小而定。

4 结论与讨论

细菌纤维素近年来作为一种新兴的生物材料，被广泛应用于众多领域，具有良好的发展前景。尽管其发酵过程相对简单，但是目前工业化生产尚在初级阶段，因此提升产BC菌发酵工艺成为急需解决的问题。不同菌种有各自的最适发酵原料、最适条件，本文论述的只是大部分菌种的适用范围。针对特定菌种的发酵生产，研究者们需要做进一步优化设计，在单因素实验的基础上，选取不同因素进行PlackettBurman(PB)试验或是BoxBehnken(BB)试验，通过响应面分析来确定最佳发酵模式。陈海超等人在研究汉逊氏葡糖酸醋杆菌(G.hansenii)用正交实验总结出当培养基组成为(g/L)：蔗糖10、酵母粉9.36、蛋白胨5、柠檬酸0.3、磷酸氢二钠2.86、初始pH为5.96、接种量为10%、培养温度为30℃、培养时间为10 d时，BC产量最高[40]。朱宏阳等针对芽孢杆菌ZF7的最佳条件设定为接种量为5%、150 r/min、32℃ 振荡培养5 d[36]。当前细菌纤维素发酵生产已有一定进展，但尚有较大的提升空间，为了细菌纤维素的大规模推广，研究者们需要探究菌种选育、发酵原料、发酵条件以及更多潜在影响因素，从产量、成本和环境安全等多个方面综合考量，注重BC产量同时也要注重产品性能，以利于细菌纤维素更好更达的利用与推广。