细菌分泌系统研究进展

岑 雪，丁雪燕，娄昆鹏，朱国强*

(1.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

细菌在长期的进化过程中不断和宿主发生互作，通过自身分泌的蛋白作用于特定的宿主细胞引起特异性或非特异性的免疫应答。细菌所分泌的蛋白在营养获得、适应环境、种内和种间信号通迅以及毒力方面起着至关重要的作用。在革兰阴性菌中，分泌的蛋白必须穿过两个膜：细胞质膜或内膜(Inner membrance，IM)和外膜(Outer membrane，OM)[1]。与革兰氏阴性菌相比，革兰氏阳性菌在结构上相对简单，因为它没有OM，因此该类菌分泌蛋白进入细胞外环境的过程中只需要穿过胞质膜和肽聚糖层[2]。细菌为了克服从胞质向细胞外空间转运多种蛋白的困难，进化出一系列专门的分泌途径，即蛋白分泌系统。

大肠杆菌溶血素A 是在革兰氏阴性菌中发现的第一种蛋白分泌系统[3]。此后，在原核生物中相继发现了不同种蛋白分泌途径。截至目前，在细菌中已经发现了9 种分泌系统，分别为 I 型分泌系统(Type I secretion system，T1SS)、II 型分泌 系统(T2SS)、III 型分泌 系 统(T3SS)、IV型分泌系统(T4SS)、V 型分泌系统(T5SS)、VI 型分泌系统 (T6SS)、VII型分泌系统(T7SS)、VIII型分泌系统(T8SS)和 IX 型分泌系统(T9SS)。细菌通过分泌系统为自身营造一个安全且营养丰富的生存环境，逃避宿主免疫杀伤，对病原菌的生存、复制和致病等起到重要作用。本综述针对上述发现的细菌分泌系统，简要介绍其最新研究进展。

1 T1SS

T1SS 装置相对简单，代表了革兰氏阴性菌细胞膜上普遍的蛋白分泌模式。T1SS 的分泌过程仅有3 种蛋白参与：内膜 ABC 转运蛋白(Inner-membrane ABC transporter，ABC)、周质膜融合蛋白(Periplasmic membrane-fusion protein，PFP)和外膜孔蛋白(Outer-membrane protein，OMP)，这3 种蛋白在含有C 末端分泌信号底物的存在下聚集，组装成跨越两个膜的复合体并为未折叠的多肽的易位提供了直接导管，使分泌的蛋白一次性穿过细胞内外膜分泌到胞外，它的显著特征是 ABC 蛋白的存在，参与水解 ATP化合物的运输[4]。大肠杆菌a- 溶血素的分泌系统即为一个典型的 T1SS[5]。

沙门菌 T1SS 由毒力岛 4 编码，其利用编码的 6 个基因参与调控细菌与真核细胞之间的黏附，促进肠道定植与感染[6]。最近 Yoshida 等在脱氧副球菌(Paracoccus denitrificans)中发现生物被膜相关蛋白BapA 通过T1SS 易位至细胞外环境，使细胞附着于底物。当BapA 位于细胞表面时，能够改变细胞表面的疏水性，促进脱氧副球菌的粘附和生物被膜形成[7]。

Christian 等通过生物信息学分析，发现在营养限制条件下，不动杆菌T1SS 中任何组分发生突变均会消除T6SS的活性[8]。事实上，T1SS 突变株的 T6SS 是在营养限制下被废除，表明这两个系统的功能活性可能被某种反应所调节，目前已经发现，铜绿假单胞菌的 T2SS 和 T6SS 受到群体感应的共同调控[9]。在不动杆菌 T1SS 突变株中，分泌抑制的调节机制是否也与群体感应的调控有关？ 还是与其它的细胞过程有联系，还尚未确定。另外，还需进一步探究分泌抑制是否具有普遍性？ 在其它细菌分泌系统中是否也存在相互关联？

2 T2SS

T2SS 是革兰氏阴性菌中的常规代谢途径，产酸克雷伯杆菌的T2SS 是最早被发现的，随后，在其它动植物细菌中均有发现T2SS。研究发现许多细菌不止一套T2SS 基因，它们在功能上的分工还需要进一步的探究。不过，Ferrandez 等发现欧文氏菌中的第2 套T2SS 可以分泌一个锚定在细菌外表面的果胶裂解酶同源蛋白PnlH[10]。

T2SS 的相关分泌蛋白主要包括胞内附膜蛋白SecA、分子伴侣SecB 和周质中的信号肽切除酶[11]。T2SS 通过二步转移将蛋白质从胞质运输到细胞外，这与T1SS 将分泌的蛋白直接从胞浆送至细胞表面的方式有很大的不同。首先，通过Sec 通路或Tat 通路将分泌的蛋白输出周质，然后由全局分泌通路转膜蛋白(General secretory pathway transmembrane protein，GSP)识别，再通过外周质在膜外转移定位。即将修饰组装后的蛋白在GSP 的帮助下穿过外膜到细胞外[12-13]。在此分泌过程中 T2SS 主要以 GSP 基因簇为中心[14]。有研究表明T2SS 在分泌过程中需要另外一套内膜及外膜蛋白作为跨越外膜的充分必要条件，即需要一个连续基因簇编码的14 个分泌因子[11]。

T2SS 的功能在于通过专用的外膜通道促进折叠的细胞周质蛋白特异性地运输至胞外，与宿主细胞靶向结合，有助于细菌适应不同的外界环境。大多数被分泌的胞外蛋白酶均能够通过水解环境中的物质，产生细菌容易摄取的营养物质。T2SS 除获取营养物质这一主要功能外，还能够分泌蛋白质，包括蛋白酶、果胶酶和毒素等，破坏宿主细胞，引起组织损伤和坏死；同时，T2SS 能够促进黏附素、黏蛋白或细胞色素的分泌，并在呼吸、运动性或生物被膜形成等方面发挥功能[15]。另外，有研究表明植物病原菌的T2SS 可以分泌鞭毛蛋白，由此推测，T2SS 可能参与鞭毛组装过程[16]。对水稻白叶枯细菌中分离获得的T2SS突变基因分析，发现该基因发生突变时，细菌毒性会受到影响[17]。总之，T2SS 在细菌的致病作用中有重要作用。

随着对 T2SS 的研究，虽然对 T2SS 的调控机制和相关分泌蛋白的功能有了一定的了解，但仍有许多问题需要解决，如T2SS 中的GSP 基因簇与相关蛋白之间的相互作用，GSP 与细菌致病力的关系等。

3 T3SS

目前，T3SS 是所有已知蛋白分泌系统中最复杂的，最初在鼠伤寒沙门氏菌中被发现[18]。之后在铜绿假单胞菌中也发现了结构类似于针管状的T3SS[19]。T3SS 不仅存在于动物病原体中，在植物病原体中也有发现，如青枯假单胞菌[20]。组成 T3SS 的 蛋白有 4 种：装置蛋白(Apparatus protein)、效应蛋白(Effector proteins)、分子伴侣蛋白(Chaperons proteins)和调 控蛋白(Regulator proteins)[19]，其中发挥毒力作用的主要是效应蛋白，通过易位运动到达细菌液泡膜上，形成孔隙，利用 T3SS 的核心结构 - 针状复合体以注射的方式注入宿主细胞内，破坏宿主细胞内的多种信号通路，并感染与定植，继而引发特定的病理反应[21]。如Bliska 等研究显示耶尔森氏菌的T3SS 的转运蛋白和效应蛋白能够调节先天性免疫应答[22]。总之，不同的病原菌通过T3SS 分泌效应蛋白作用于宿主产生不同的疾病和症状，在致病作用中发挥着重要作用。

大多数细菌只有一个T3SS，但一些病原体具有多个T3SS，如伤寒沙门氏菌有两套完全独立的T3SS，其在发病机理的不同方面独立或者协调作用。沙门氏菌的T3SS主要由 SPI-1 和SPI-2 基因编码的效应蛋白起作用，通过将这些分泌蛋白转运至宿主细胞激活传导通道，或者促使在沙门氏菌表面装配侵袭小体，促使细胞凋亡[23]。

最近在分析肠出血性大肠杆菌O157:H7 的基因组序列时，发现一个新的 T3SS- 大肠杆菌 III 型分泌系统 2(Escherichia colitype III secretion system 2，ETT2)毒 力 岛[24]。它与沙门氏菌的T3SS 虽然同源，但却存在差异。如在沙门氏菌中编码T3SS 注射装置内环的重要蛋白spaR 在ETT2 中是以 epaR1 和 epaR2 的形式存在[25]。虽然已经了解到ETT2 编码的效应蛋白对大肠杆菌分离株功能和毒素的分泌有影响，但是对于ETT2 毒力岛的功能和机制却了解很少。

随着对组成T3SS 4 种蛋白的进一步研究，发现有新的调控因子也参与调控T3SS，如双组分系统、小RNA 调节子等。然而人们对T3SS 的认识还远远不够，还存在许多未知领域，有待进一步深入研究。

4 T4SS

T4SS 在革兰阳性菌和革兰阴性菌中均有发现，它们通过接触依赖的效应分子分泌到真核宿主细胞中，移动DNA 元件的接合转移以及与细胞外环境DNA 的独立交换对细菌生存、增殖和致病等发挥重要的作用[26]。Lederburg和 Fatum 最早于 1946年发现大肠杆菌 F 质粒的 T4SS 接合系统，参与遗传物质的细胞间转移[27]。T4SS 的结构根据蛋白功能分为4 个功能单位：四型偶联蛋白(Four - type coupling proteins，T4CP)，参与募集 DNA 和传递过程；膜内复合物(Inner membrance complex，IMC)，介导分泌物内膜转运；跨膜通道复合物(Outer membrane complex，OMC)，形成通道介导分泌物运输入胞外环境；接合菌毛，是与受体细胞结合的胞外结构[28]。区别于其它的分泌系统，T4SS 也能够转运蛋白质和核糖核蛋白复合物，这与细菌的致病性密切相关。

近年来，多种病原菌的T4SS 效应蛋白被发现，其效应蛋白的生物学功能逐渐成为研究热点。效应蛋白的作用主要体现在以下几个方面：抑制吞噬体与溶酶体融合，逃避宿主细胞降解，如T4SS 能够有效阻止布氏小体与溶酶体相互作用，使布氏杆菌能够在细胞中生存[29]；抑制宿主细胞凋亡，研究表明嗜吞噬细胞无形体的T4SS 的效应蛋白 Ats-1 可以在线粒体水平抑制细胞凋亡[30]；营养供应，T4SS 可以大量募集到效应蛋白，协同为嗜肺军团菌提供营养[31]；释放毒力因子，如幽门螺旋杆菌利用 T4SS 转运细胞相关毒素cagA、cagL 从而导致胃黏膜病理改变[32]。

在过去几年中，T4SS 机制的诸多细节已经被探究，比如 F- 菌毛的结构报道[26]。此外，T4SS 的第一个原位图像冷冻电子断层扫描术，这意味着在其原生膜环境中对T4SS 结构的定义有了新方向[33]。研究发现柑橘黄单胞菌采用T4SS 以接触依赖方式杀死紧邻的竞争细菌，进一步突出了这个分泌超级大家族的生物多样性[34]。最近有研究表明T4SS 也是潜在治疗性DNA 向人类细胞输入的可行载体[35]。因此，T4SS 的研究前景非常广阔。

5 T5SS

T5SS 为革兰阴性菌外膜通道转运蛋白系统中最大的一个家族，又称自主转运蛋白系统。T5SS 与 T2SS 一样，也分成二步分泌。首先与细胞内膜上的Sec 复合物结合，穿过内膜到达外周质间隙，再利用 β 折叠桶实现跨外膜分泌[36]。T5SS 装置蛋白的一级结构域包括 4 个：信号化序列、载客结构域、转运结构域和连接结构域[37]。

根据跨越外膜的特性，可以将 T5SS 分为 5 个亚型(Va-Ve)：经典的Va 单体自主转运，如来自奈瑟氏菌的蛋白IgA 和大肠杆菌的黏附素AIDA 均属于这种类型[38]；Vb单体自主转运系统；Vc 3 聚体自主转运系统；Vd 自主转运系统，最初它是在假单胞杆菌中发现[39]；Ve 自主转运系统，它是在紧密粘附素和侵袭素中发现的一种新型转运系统[39]。

之前一直认为T5SS 的分泌装置最为单一，且转运过程中似乎不需要能量和辅助因子的参与，但是越来越多的研究表明，细菌细胞膜中的多种因子是自主转运蛋白所必需的。通过外部跨膜 “ β- 桶状结构域”的组装，促进了其可溶性效应物跨越外膜分泌[40]。在转运过程中，需要β桶装装置复合物，催化外膜蛋白整合至脂质双层中[41]。在大肠杆菌中，敲除 BamA 蛋白同源基因，会导致 β 桶装装置复合物错误折叠而不能正确质插入到外膜，从而导致细菌的死亡[42]。有研究猜测：T5SS 使用发夹中间体启动载客结构域的移位，而Bam 复合体(或其旁系物Tam 复合物)在易位孔的膜插入中起作用[43]。但是，Bam 复合体参与每一个自主转运系统吗？ 有必要研究 Tam 在自转运生物合成中的作用及其与Bam 复合物的合作方式。

6 T6SS

T6SS 属于Sec 依赖性分泌系统。Pukatzki 等在霍乱弧菌中发现了IAHP 基因簇能够编码一种对细菌感染有重要作用的新的蛋白分泌系统，命名为 T6SS[44]。研究表明，近25 %的革兰阴性菌有具编码 T6SS 的基因。T6SS 的基因簇通常编码12～25 个蛋白，其中的13 个保守基因最为关键，通过生物信息学方法分析，可以将这些基因簇编码的蛋白大致分为3 类：编码与噬菌体样结构相关的蛋白，如 Hcp、VgrG、TssB、TssC、TssE；编码与跨膜结构相关的蛋白，如膜蛋白 TssL、TssM、脂蛋白 TssJ；编码功能未知的蛋白，如 TssA、TssF、TssG、TssK[45]。当然，除了保守的13 个核心元件，其它的辅助原件与T6SS 基因簇也必不可少。

T6SS 的结构很特殊，被称为噬菌体样结构，以倒置的形式镶嵌于细胞膜上。众所周知，噬菌体利用尾部附着在细菌的表面，再把头部的DNA 注入细胞内；然而与噬菌体结构相比，T6SS 首先要穿过细菌自身的细胞膜，再将分泌物质注射到宿主细胞内[46]。T6SS 的结构包含一个跨膜结构亚装置和一个噬菌体样结构亚装置(包括噬菌体鞘、尾管、尾部刺突蛋白和基板等)。T6SS 与噬菌体的高度同源性让科学家猜测具有T6SS 的病原菌可以在一定程度上抵御噬菌体的感染，这种噬菌体样结构也是将效应蛋白转运到受体细胞内的蛋白转运通道[46]。

T6SS 的主要作用是提高细菌对环境的适应能力，介导细菌对宿主细胞的致病力。通过Red 同源同组获得缺失了T6SS 结构基因和转位基因的鳗弧菌在比较严苛的条件下，缺失株的存活率明显低于野生株[47]。缺失了编码T6SS组分基因的爱德华氏菌缺乏了感染蓝色古拉米鱼的毒力[48]。在某些情况下，特定的 T6SS组分有助于发挥其毒力作用，可能采取的是与T6SS 的其它组分无关的方式。如农杆菌和弗朗西斯氏菌的毒力作用只与特定的基因有关，似乎不需要T6SS 编码基因的参与[48]。

研究发现T6SS 不仅与细菌的发病机制有关，也能够促进细菌和真核生物之间的共生或互惠关系，以及介导细菌之间的合作或竞争性相互作用[48]。利用T6SS 的这种生物学特性将来其有望成为制备新疫苗与抗生素的新靶点。

7 T7SS

T7SS是近年来发现的仅存在于革兰氏阳性菌的特殊系统。在革兰氏阳性菌中，部分蛋白不带典型信号肽序列，在不能通过Tat 或Sec 途径输出周质的情况下，需要借助一种新的替代蛋白分泌途径，即与牛结核分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)毒力有关的 RD1 区编码的蛋白分泌系统，也就是 T7SS[2]，表明最早发现的T7SS 是结核分枝杆菌的分泌系统。分枝杆菌中存在5 个不同的基因座，但大多数菌种由于基因变异或基因删除的原因导致其含有的T7SS 基因并不完整[49]。

T7SS 分泌的毒力相关蛋白主要是ESAT-6/WXG100 蛋白家族，并且该途径在机理上不同于其它分泌系统，因为所有蛋白似乎在分泌过程中彼此依赖[50]。目前，对该蛋白家族中研究较为普遍的是ESAT-6 和 CFP-10，现在也称为EsxA 和 EsxB。研究显示 ESAT-6 能够介导结核分枝杆菌在巨噬细胞中形成利于其自身生存的泡沫环境，CFP-10与ESAT-6 相互依赖参与并促进这一过程[50]。而 Pro-Pro-Glu (PPE)蛋白是分枝杆菌特有的，虽然其生物学功能还需进一步探究，但是可以确定的是，细菌可以诱导该蛋白表达以阻止感染过程中产生过量的对细菌有毒性作用的NO 来实现自我保护，对细菌的定植有重要作用[51]。

MielichSüss 等研究显示：在金黄色球菌中，细菌的功能膜微区(Functional membrane microdomain，FMM)处的支架蛋白 flotillin 能够介导T7SS 蛋白的分子间相互作用[52]。因此，通过靶向细菌的 flotillin，能够干扰 FMM组织，降低 T7SS 功能，从而抑制 T7SS 介导的 EsxA、EsxB 和 EsxC 底物的分泌。因此抗 FMM 化合物，抑制支架蛋白flotillin 活性可能是一个创新性的抗微生物策略，可以降低持续感染期间金黄色葡萄球菌的毒力，以治疗金黄色葡萄球菌的感染。

8 T8SS

T8SS 也称为成核 / 沉淀途径(The nucleation/precipitation pathway)，是 Curli 生物合成系统[53]，主要分泌用于组装线性细胞外纤维的蛋白。Curli 是一种典型的附着在细胞基质外的功能性淀粉样纤维。

Curli 由两种亚基组 成 ：CsgA 和 CsgB。CsgA 在细菌外部的组装离不开 Curli 亚基 CsgB 成核蛋白的参与[54]。CsgG 寡聚脂蛋白稳定地镶嵌在细胞外膜上，负责输送Curli 途径中最大亚基CsgA 和最小亚基CsgB 到细胞外[55]。CsgA 和 CsgB 一旦分泌到细胞外膜外侧，CsgB 作为成核剂诱发 CsgA 聚合，通过 T8SS 形成细胞外基质纤维[56]。此外，研究发现 CsgE 和CsgF 同样在调控 CsgA 的聚合中发挥重要的作用[54]。因此，Curli 的生物合成过程均需 CsgE 和 CsgF 的参与。目前还发现 CsgF 在 Curli 生物合成途径中也起重要作用，但是其具体的作用还不清楚。

Cuili 具有促进生物被膜形成和逃避补体介导的杀伤作用，以抵抗恶劣的外界环境[57]。研究显示CsgA 和CsgB突变株缺失了表达Curli 菌毛的功能，与野生型菌株相比，突变体的生物被膜形成能力显著降低[58]。使用菌血症小鼠模型来评估在免疫应答情况下产生Curli 的亲本和卷曲缺陷突变体中大肠杆菌的存活。结果显示，Curli 的产生增加了大肠杆菌的存活数，进一步研究显示Curli 通过抑制经典的补体途径来防止大肠杆菌对补体介导的杀伤[57]。

Curli 的前体是淀粉状蛋白，已知人类淀粉状前蛋白甲状腺运载蛋白(Transthyretin，TTR)在体外抑制淀粉状蛋白 -β(Amyloid-β，Aβ)的聚集和沉积[59]，表明 TTR 具有抗淀粉样蛋白的活性。Jain 等也在研究过程中证实了这一观点：TTR 可以以伴侣样方式抑制淀粉样蛋白的活性，从而抑制 Curli 的生成和细菌生物被膜的形成[59]。因此，TTR 可能被用来加强治疗或预防以生物被膜形成为特征的细菌感染。

9 T9SS

T9SS 是仅在一些拟杆菌门细菌中新发现的蛋白分泌系统，也称为 Por 分泌系统(PorSS)或者 PerioGate。如鸭疫里氏杆菌、约氏黄杆菌、牙龈卟啉单胞菌[53]。目前其在约氏黄杆菌和牙龈卟啉单胞菌研究中较为深入。

在牙龈卟啉单胞菌和一些其它牙周病原体中，T9SS可跨越外膜转运蛋白，特别是毒力因子。通过缺失突变研究显示，18 个基因已经被证明对于牙龈卟啉单胞菌发挥T9SS 功能是必需的。任何这些基因的缺失均会导致白色素沉着和周质中效应蛋白(如牙龈卟啉单胞菌)的聚积[60]。这些蛋白在IM 和OM 中构建核心结构，一些蛋白发挥调控或辅助作用，另一些则参与翻译后修饰效应蛋白。

T9SS 不仅能够介导致病作用，还可以提供一种运动方式(称为滑行运动)。牙龈卟啉单胞菌的T9SS 逃避免疫应答，参与破坏人类组织的致病过程，如 Skp 样蛋白[61]，表明T9SS 参与毒力因子分泌。另外，在porT 阳性没有致病性的拟杆菌中，如约氏黄杆菌，它们是能够使用滑行运动的能动性微生物，因为这些细胞不具有鞭毛或菌毛，只能依赖于一种由类杆菌属特有的蛋白组成的新型动力机器，使得它们在环境中无处不在。SprB 和 RemA 是 T9SS递送到细胞表面的与滑动有关的移动粘附素，但是关于T9SS 参与滑行运动的机制仍然不很清楚[62]。

10 小结与展望

细菌为了与周围环境和宿主细胞更好的相互作用，进化出了许多种蛋白分泌途径。目前，已经发现了9 种蛋白分泌系统，对这9 个分泌系统以及各分泌系统结构功能的深入探究将会成为今后细菌分泌系统研究的重点。一旦这些研究有所突破，将会为了解细菌致病机制、遗传进化和推进疫苗药物的研发提供理论基础，也将促进分泌系统在医药和生物技术领域的更广泛的应用。