CRISPR/Cas9 系统在猪基因编辑中的研究进展

李 尚，石 岗，冯韶华，张正敏，周一彤，芦春莲，曹洪战

（河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001）

CRISPR/Cas9 系统由规律成簇间隔短回文序列（CRISPR）和CRISPR 相关蛋白9（Cas9）组成，广泛存在于细菌和古菌中，是机体长期进化形成的由RNA 指导的降解外源遗传物质的适应性免疫系统。由于该系统可以识别靶向序列完成DNA 双链切割，因此自2013 年起，CRISPR/Cas9 系统被改造为基因编辑工具，其具有设计简单、特异性强、效率高等优点，为基因组定向改造调控和应用带来了突破性革命，并在一些领域中得到广泛研究和应用。而因为CRISPR/Cas9 存在脱靶效应和外源基因插入困难等问题，在一定程度上限制了CRISPR/Cas9 的应用。

1 CRISPR/Cas9 系统

1.1 CRISPR/Cas9 系统的组成及功能 根据PSSM 矩阵库（NCBI 提供）综合分析基因组数据，在原来Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型基础上引入了新型Ⅳ和Ⅴ[1]。近年来根据CRISPR系统Cas 编码的复合物将上述Ⅰ～Ⅴ分为“1 类”和“2类”。1 类系统具有多重亚基crRNA 效应子复合物，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型CRISPR 系统，2 类系统的效应子复合物都是Cas9，包括Ⅱ和Ⅴ型CRISPR 系统[2]。Ⅱ型（CRISPR/Cas9）系统是CRISPR/Cas 系统中最简单，也是目前研究最为彻底、应用最为广泛的系统。

完整的CRISPR 位点依次包括Cas 基因、前导区以及由短回文重复区（repeat）和间隔区（spacer）构成的CRISPR 序列。上游Cas 基因有丰富的多态性，编码蛋白有核酸酶的功能；前导区可看作CRISPR 序列的启动子，激活转录；下游CRISPR 序列中的回文序列一般21～48 bp，可形成发卡结构；间隔区即细菌捕获外源DNA，相当于细菌建立“黑名单”，产生获得性免疫[3-4]。

1.2 基因编辑技术 基因组特定位点的DNA 双链断裂（DSB）可以激活细胞内部的修复机制，进而大幅度提高同源重组的效率。DNA 双链断裂，在DSB 处产生的非同源末端连接（NHEJ）和同源介导修复（HDR）修复机制可以对基因组进行灵活修饰，预示了基因编辑的到来。为了在基因组特定位点引入DNA 双链断裂，多种定制化的核酸内切酶被陆续开发应用，主要包括锌指核酸酶（ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）和CRISPR/Cas9 系统。

相比于传统的基因编辑技术，ZFN 和TALEN 出现大大提高了基因打靶效率，并且高效地实现了对基因组的定点操作以及基因表达调控，如定点插入、删除和替换、转录抑制或激活等，但由于操作复杂、成本高等特点限制了这两项技术的发展。而CRISPR/Cas9 系统作为第3 代基因编辑技术，相比于ZFN 和TALEN，有着无可比拟的优点：CRISPR/Cas9 系统可以对所有基因组进行编辑；具有可控性；可在1 个细胞内同时进行多个基因编辑，提高编辑效率；操作简便，几乎任何分子实验室都可开展。但同时CRISPR/Cas9 系统也存在脱靶效应，这是由Cas9 蛋白能够在sgRNA 与靶序列之间存在错配的情况下继续进行识别导致的，目前可通过提高sgRNA 特异性、控制Cas9-sgRNA 用量、改造Cas9等改善CRISPR/Cas9 脱靶效应[5]。

2 CRISPR/Cas9 在猪研究中的应用

自2013 年CRISPR/Cas9 基因编辑技术第1 次运用到哺乳动物细胞以来，CRISPR/Cas9 技术发展迅速。猪作为一种重要的农业经济动物，由于其在基因组、解剖、生理代谢和疾病特征以及器官大小和功能上与人类十分相似，因此也是非常理想的大动物模型。CRISPR/Cas9技术为猪遗传改良、抗病育种、构建人类疾病模型及异种器官移植等方面的研究提供了新的思路和手段，极大地推动了畜牧业和生物医学领域等方面的研究[6-7]。

2.1 CRISPR/Cas9 技术加快猪遗传改良 使用CRISPR/Cas9 技术对猪遗传改良的研究通常会结合细胞核移植（SCNT）技术和胚胎移植（ET）技术的应用。利用CRISPR/Cas9 得到基因敲除或敲入猪对提高猪生产性能和加快遗传改良等方面具有推动作用。

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）作为转化生长因 子-β超 家 族（Transforming Growth Factor-βSuperfamily，TGF-β）的成员，是骨骼肌发育和生长的主要抑制剂[8-9]。在牛、绵羊和狗等动物中已经发现MSTN 天然突变在提高瘦肉率等肉质性状的同时也出现了一些副作用，如繁殖力降低、难产等。随着基因编辑技术的发展，产生的编辑动物在表现出一些理想表型（如双肌表型、快的生长率等）的同时，也出现了副作用。如欧洲猪种中产生的MSTN 突变、杂合体敲除猪表现出瘦肉率增加，并且背膘厚度减少，但是几乎所有纯合子敲除的仔猪都会表现出一些与健康有关的问题，并在出生后几天内死亡[8]。Wang 等[9]使用CRISPR/Cas9 和SCNT 在二花脸猪中产生MSTN 突变，表现出部分双肌表型，如突出的肌肉、较宽的背部和臀部等，并且含有纯合突变的二花脸猪不像大白猪一样常出现健康问题。MSTN 敲除可能有助于提高中国本地品种的生产性能，但还需进一步选择育种。

胰岛素样生长因子2（Insulin-like Growth Factor 2，IGF2）是一种母系印记生长因子，通过与IGF1 受体（IGF1R）结合并激活下游信号通路来调节细胞增殖、分化与凋亡，以促进骨骼肌生长。猪IGF2 内含子3 内的SNP 破坏阻遏物ZBED6（Zinc Finger BEDtype Containing 6）的结合位点，使骨骼肌中IGF2上调，并对肌肉生长、心脏大小和脂肪沉积产生主要影响。这种有利突变在西方商业猪群中常见，而在中国大多数本地品种中不存在。因此，Liu 等[10]以两广小花猪为研究对象，有效破坏猪胎儿成纤维细胞（PFF）中IGF2 内含子3 中的ZBED6 结合位点，再利用SCNT产生IGF2 编辑猪，明显增强了肌肉发育，提高了两广小花猪的瘦肉率，猪的生活率虽符合预期，但大多数在早期死亡，也易感染地方性流行肺炎（Swine Enzootic Pneumonia，SEP），其中也由于缺乏护理经验，使SEP 猪早期死亡。Xiang 等[11]提到，由于每个基因通过与转录网络相互作用发挥其独特功能，敲除内源基因除了获得所需表型，还可能潜在地改变更多的表型；转基因引入通常携带外源因子，这可能导致可预见的效果，该团队通过编辑巴马猪IGF2内含子3-3072 位点，不仅改善其肉产量，也第一次证明了编辑非编码区可以改善家畜经济特征。Zheng 等[12]利用CRISPR/Cas9 介导的非同源重组整合外源片段的方式，通过SCNT 和ET构建出解偶联蛋白1（UCP1）基因定点KI 猪（效率为11.5%），仔猪耐寒，成年后胴体品质得到改善。

2.2 CRISPR/Cas9 技术在抗病育种中的应用 猪病频发是当前中国生猪产业面临的重大问题，单纯依靠防疫和药物治疗已无法彻底防控猪病。随着动物基因组计划研究的深入，有关疾病的致病基因、候选基因、QTL 不断被揭示，用遗传学方法从遗传本质上提高猪群的抗病力，开展抗病育种具有治本的功效，而CRISPR/Cas9为抗病育种的研究提供了思路和手段[13-14]。

猪繁殖与呼吸综合症（PRRSV）以妊娠后期母猪流产等繁殖障碍为主要特点。病毒只有通过表面特异性受体结合后才能进入细胞，因此病毒相关受体对致病力影响很大。与PRRSV 相关的受体主要包括硫酸乙酰肝素样物质、唾液酸粘附素、CD163 以及某些未知受体。研究证实，CD163 是PRRSV 感染猪的必需受体，CD163 中的SRCR5 为PRRSV 感染所必需[15-16]。Whitworth 等[17]利用CRISPR/Cas9 技术靶向2 种内源基因（CD163和CD1D）和1 种转基因（eGFP），通过显微注射Cas9 mRNA 和sg RNA 及SCNT 获得敲除CD163基因的编辑猪，但由于CRISPR/Cas9 在同一胚胎内同时有效靶向2 个基因，难以确定单基因作用。王少华等[18]利用CRISPR/Cas9n 系统结合SCNT，成功获得了2 头正常存活的CD163基因编辑克隆猪。Burkard 等[19]在猪受精卵中敲除了CD163基因的外显子7，这些猪表达缺乏SRCR5 的CD163 蛋白（ΔSRCR5 CD163），并表明ΔSRCR5 猪在标准饲养条件下是健康的，并且在保存PRRSV 抗性的同时保持CD163的生物学功能。

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒（PRV）引起的猪急性传染病，可引起妊娠母猪及新生仔猪发病，是危害全球养猪业的重大传染病之一。Xu 等[20]研究发现，通过CRISPR/Cas9 系统将纯化的PRV基因共转染到具有差的转染效率的PK15 细胞中，其编辑的PRV基因获得了高达100%的基因缺失病毒，可作为较好的载体用于疫苗研发。Tang 等[21]同样对PRV进行编辑，可阻断病毒的复制，并有可能成为控制PRV 的新的有效手段。

猪圆环病毒血清型2，即PCV2 为致病性病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。在信号传导途径中，p53 信号传导对于控制静止细胞进入细胞周期和调节细胞DNA 复制至关重要。研究表明PCV2 的感染通过上调p53 诱导宿主细胞凋亡[22]。为了进一步确定p53 信号在PCV2 感染过程中的作用，Xu 等[22]建立了p53 基因敲除PK15 细胞系，表明PCV2 感染通过激活p53 途径诱导S 期积累，以促进宿主细胞的病毒复制。但p53 信号传导的确切分子机制仍需要进一步研究。

猪瘟由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、发热、接触性传染传染病，具有高度传染性和致死性，对猪危害极为严重。Xie 等[23]将shRNAs 敲入猪pROSA26 基因座，再通过SCNT 产生抗-CSFV 转基因猪（TG），体外和体内病毒攻击实验证明，这些TG 猪可以有效地限制CSFV 的复制并降低CSFV 相关的临床体征和死亡率，且疾病抗性可以稳定地传递给F1 代，但在TG 猪中观察到一些临床症状和病毒血症。Lu 等[24]成功地将外源shRNA 整合到猪miRNA-17-92（pmiR-17-92）簇中，可以在pmiR-17-92 簇的内源启动子的控制下稳定且有效地表达抗EGFP或抗CSFV shRNA。

随着研究的进一步深入，CRISPR/Cas9 系统与其他技术的结合必将推动抗病育种的研究。抗病基因编辑猪的制备不仅能为研究猪发病机制提供重要模型，而且能减少因疾病引起养猪业的经济损失，推动养猪业的健康快速发展。

2.3 利用CRISPR/Cas9 技术建立人类疾病模型 猪在解剖学、生理病理学、营养代谢和疾病特征等方面都与人类相似度较高，基因修饰猪现已是疾病发生机制、病理毒理研究、治疗药物评估等众多领域所需的重要动物模型。但是，大型基因修饰动物模型生产难度大、步骤繁琐、耗时长、成本高昂。随着基因编辑技术的突破，CRISPR/Cas9 技术大大提高了基因突变效率，降低了基因修饰动物模型的造模成本，同时简化了步骤，推进了基因修饰猪的广泛应用[25]。

目前，利用CRISPR/Cas9 系统和其他技术相结合成功建立了人类疾病的猪模型。使用血管性血友病因子（vWF）双等位基因的巴马小型KO 猪构建了人类临床Ⅰ型和Ⅱ型血管性血友病模型，但vWF突变会有严重的出血倾向，其出血时间高于野生型[26]。酪氨酸酶（TYR）双等位基因KO 猪表现出了典型白化病症状[27]。人诺如病毒（HuNoVs）免疫缺陷型（RAG2/IL2RG KO）猪具有免疫缺陷特征，与野生型相比，RAG2/IL2RG缺陷猪感染时间延长[28]。通过敲除DJ-1、parkin及PINK1[27]，PARK2和PINK1[29]，E46K、H50Q及G51D[30]以期产生帕金森病（PD）模型，均表明几个月不足以使小型猪大脑发生类似PD 的病理变化，且7 个月时没有观察到帕金森病的典型症状。饲喂HFHC（30%饱和脂肪和1.5% 胆固醇，连续3 个月）日粮的ApoE KO 巴马香猪模型表现出严重的高胆固醇血症并发展为进行性动脉粥样硬化病变[31]；敲除Apo E与LDLR的基因编辑猪表现出与动脉粥样硬化相关的异常脂质代谢，为人类心血管疾病的研究建立有价值的动物模型[32]。Hoxc13 KO 猪产生的外胚层发育不良（Ectodermal Dysplasia-9，ED-9）猪模型，其表型与ED-9 患者表型相似，但也表现出异常表型，如毛囊数量减少等，其产生的无异常表型的无毛猪可能是其他皮肤病学的有效模型[33]；使用CRISPR/Cas9 靶向已知肿瘤抑制基因RUNX3，RUNX3 KO 猪可作为人类癌症研究和开发的有用资源[34]等。虽然，一些疾病模型会表现出一些副作用，但可为人类疾病研究建立有价值的模型提供参考。

2.4 CRISPR/Cas9 在异种器官移植上的研究 尽管猪被认为是人体异种器官移植的首选动物，但由于免疫排斥和内源性逆转录病毒（PERVs）使得猪的器官移植成为障碍。

导致宿主对猪器官发生超急性排斥反应的表面抗原主要包括由α-1，3-半乳糖基转移酶（GGTA1）、胞苷单磷酸 N-乙酰神经酸羟化酶（CMAH）、异红细胞糖苷酯合成酶（i Gb3S）基因以及β4GALNT2基因等。为克服猪与人之间的生物学不相容，其中一种做法是去除猪细胞和组织上存在的主要抗原，如Gal、Neu5Gc 和 Sd（a）。Gao 等[35]采用CRISPR/Cas9 和HMC 技术产生了GGTA1/CMAH双敲除（DKO）猪，在异种移植中表现出体液排斥降低，证明GGTA1/CMAH DKO 细胞比GGTA1-KO细胞更有效地免受体液应答。Martens 等[36]敲除猪胚胎内GGTA1、CMAH和β4GALNT2后克隆出三基因敲除猪（TKO），发现人类血清对TKO 细胞的异种免疫抗性结合显著减少。Wang 等[37]通过CRISPR/Cas9靶向产生3 个基因（GGTA1、CMAH和β4GalNT2）TKO，TKO 猪的抗原性显著降低，并且猪组织中剩余的异种抗原可以通过基因靶向方法消除。

移植器官短缺是器官衰竭治疗的主要障碍。尽管异种移植是减轻人类器官移植短缺的期望策略，但猪内源性逆转录病毒（PERVs）跨种传播的风险阻碍了该方法的临床应用。Yang 等[38]对猪肾细胞系（PK15）中所有62 个拷贝的PERVs pol基因进行敲除，猪内源性病毒传递给人的风险下降到以前的 1/1 000 以下，其证明PERVs 可能被灭活用于异种移植临床应用。Niu 等[39]通过分析猪PFF基因组，利用 CRISPR/ Cas9使25 个PERVs 基因失活，通过SCNT 技术成功克隆诞生世界首批内源性逆转录病毒灭活猪，其研究强调了PERV 灭活以防止跨物种病毒传播的价值，并证明了以生产PERV 灭活动物解决临床异种移植中的安全问题。Al-Shehabi 等[40]强调SAMHD1 是一种潜在的屏障，在异种器官移植过程中阻止猪移植到人类受体的PERV 传 播，通 过SIVmac Vpx 或CRISPR/Cas9 敲 除SAMHD1，以允许PERV 逆转录。

另外，应用CRISPR/Cas9 系统对相关基因进行敲除为建立大动物体内产生人类脏器的生成奠定基础。Wu等[41]应用CRISPR/Cas9 系统对猪胚胎中胰腺发育相关基因PDX1进行敲除，为结合人类多能干细胞（hPSCs）移植建立大动物体内再生人类胰腺的平台奠定基础。Wang 等[42]使用CRISPR/Cas9 系统结合SCNT 技术成功地生成了SIX1和SIX1/SIX4靶向猪胎儿，而肾脏缺陷的猪胎儿的产生为利用囊胚互补技术在猪体内产生人类肾脏提供了一个平台。

CRISPR/Cas9 能够快速生成含有多个定制遗传修饰的基因编辑猪，预期这些修饰对猪-人异种移植的功效和安全性具有积极影响。CRISPR/Cas9 将在推动异种移植到临床应用中发挥重要作用。

3 CRISPR/Cas9 潜在脱靶活性分析

虽然CRISPR/cas9 已证明其编辑效率，但该系统缺乏避免通过靶基因组引入不希望的突变的能力。事实上，当CRISPR/cas9 系统不仅只切割基因组上的目标区域时，它可能产生无法预见的脱靶编辑，这可能会造成潜在的有害影响[43]。

CRISPR/Cas9 系统对猪进行基因编辑的相关研究分析了其脱靶效率。Whitworth 等[17]研究显示，较高浓度的CRISPRs 可以提高体细胞的靶向效率，但结果没有统计学差异；王少华等[18]经鉴定获得了编辑CD163基因的细胞克隆点，其阳性率为90%；Huang 等[32]成功扩增出28 个潜在脱靶位点（OTs），其中2 个位点的OTs 周围有重叠峰；Yang 等[38]研究表明，连续诱导Cas9 会使PERVs 的靶向频率增加，且在17 d 观察到最大靶向频率为37%；Wu 等[41]使用的双sgRNA 指导的Cas9 核酸酶产生59% 的突变胚泡，提示Cas9 和双重sgRNA 的组合是猪胚胎基因敲除和大DNA 片段突变筛选缺失的有力平台；Carey 等[44]通过将CRISPR/Cas9系统直接注射到发育中的胚胎中，脱靶的发生率很低，但这些事件无法准确预测，每个CRISPR/Cas9 系统的脱靶频率应在其应用于临床之前进行有意识的评估。

另外，在对小鼠的研究中，Iyer 等[45]引入了毛色酪氨酸酶（Tyr）基因座的突变，还发现了几种不期望的脱靶突变。Anderson 等[46]将来自小鼠和大鼠基因组的81 个基因组编辑项目的深度测序数据进行分析，表明在1 423 个预测的脱靶位点，其中32 个被证实，并且表明高保真Cas9 版本降低了体内的脱靶突变率。Aryal 等[47]在来自200 个注射受精卵的38 只小鼠中，观察到40%（15/38）的目标效率通过NHEJ；5%的小鼠（2/38）通过HDR 引入预期突变。

总体而言，目前可用的CRISPR/cas9 应用存在脱靶效应时仍然存在高度可变性，表明仍不能基于该基因组编辑系统对所有实验进行稳健预测[48]。如果具有挑战性的不良影响得到解决，采用CRISPR/cas9 系统进行的基因组编辑技术可更好地用于研究和临床[43]。

4 小 结

自2013 年起，CRISPR/Cas9 系统被改造为基因编辑工具，其设计简单、特异性强、效率高等优点使其在一些领域得到广泛引用，但是CRISPR/Cas9 潜在的脱靶活性在一定程度上限制了其应用。而随着CRISPR/Cas9 系统的不断改进和优化以及新的Cas 系统（如eSpCas9、Hypa Cas9、HeFSpCas9s 等）出现，CRISPR/Cas9 系统的缺点被不断完善。另外，CRISPR/Cas9 系统与其他技术的结合使得效率提高，成本降低，应用范围也将更加广泛。近年来，CRISPR/Cas9 系统在猪遗传改良、抗病育种、构建人类疾病模型及异种器官移植等方面的研究逐渐改善，虽然建立了一些动物模型，但还是会出现一些副作用，产生的基因编辑猪还需后续观察其基因编辑效果。