罗氏沼虾病毒病检测和免疫防治进展

2019-01-11翁宏飚沈卫锋牛宝龙

浙江农业科学 2019年1期

翁宏飚，沈卫锋，牛宝龙

(浙江省农业科学院 a. 蚕桑研究所，b. 水产研究中心，浙江杭州 310021)

罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)属长臂虾科沼虾属，又称马来西亚大虾、白脚虾、金线虾、淡水长臂虾等，主要生活于淡水或咸淡水水域中，具有生长快、食性广、肉质营养成分好、养殖周期短等优点，有“淡水虾王”之称，经济价值高，是世界性大型淡水虾养殖品种。罗氏沼虾于1976年从日本引进我国，是目前我国重要的水产经济虾类。相比其他养殖虾类，罗氏沼虾体质较为强壮，有较强的抵抗力，但是随着养殖方式改变和养殖环境恶化，罗氏沼虾养殖发病风险大大增加。从20世纪90年代中期开始，罗氏沼虾养殖过程中疾病呈现暴发趋势。根据病原不同，可将罗氏沼虾病害分为寄生虫病、真菌病、细菌病和病毒病。生产上主要通过养殖环境调控、药物防治及免疫增强剂应用等方法，对罗氏沼虾的寄生虫病、真菌病和细菌病进行防控[1]，而关于罗氏沼虾病毒病，生产上尚无有效的防治措施。近年来，国内外许多学者尝试应用免疫技术对罗氏沼虾白尾病进行防治，本文重点就引起该病的诺达病毒(MrNV)免疫防治研究进展做综述，以期为今后有效防控MrNV提供参考。

1 罗氏沼虾病毒病

目前已明确的罗氏沼虾病毒病主要有2种。一种是通过消化道感染的细小病毒样病毒病(HPV)[2]，镜检可观察到被感染的肝胰腺上皮细胞细胞核变大，其中有嗜碱性包涵体，电镜观察可见直径约29 nm的20面体病毒颗粒，病症与昆虫浓核病病症相似。中国对虾(Penaeuschinensis)的HPV探针不能与罗氏沼虾HPV杂交，说明两者基因组差异较大，两种HPV没有亲缘关系，或亲缘关系较远[3]。另一种是表现为白尾症状的肌肉坏死病，被称为罗氏沼虾白尾病。该病主要在苗种期爆发，发病虾苗在短时间内大量死亡，发病幼苗的肌肉呈白浊现象，也被通称为罗氏沼虾肌肉白浊病，对罗氏沼虾生产的危害较大[4]。该病最早报道于法国瓜德罗普岛，取病虾肌肉组织的超薄切片进行电镜观察，可见被侵染细胞的细胞质中有0.5～3 μm的嗜碱性病毒包涵体颗粒[5]。之后，该病陆续在中国[6-7]、印度[8]、泰国[9]、印度尼西亚[10]、澳大利亚[11]等地被报道，从病虾组织中均可同时分离到诺达病毒(MrNV)及其卫星样病毒(XSV)[12]。感染实验表明，MrNV是引起该病的主要病原[13]。该病主要感染对象是罗氏沼虾幼苗，发生在蚤状幼体发育结束后的幼虾时期。对罗氏沼虾成虾攻毒后，虽然在多个组织中可以检测到病毒，但很少会导致成虾死亡，带毒而不表现出症状的成虾很可能是病毒水平传播的宿主[8]。多种水生昆虫可携带MrNV病毒，可能在病毒传播中起作用[14]。病毒还可以感染不同发育阶段的卤虫，因此卤虫也是病毒传播过程的中间宿主[15]。病毒除水平传播外，在带毒亲虾的卵巢组织中也可检测到病毒，推测该病还可通过垂直传播途径传播[8]。MrNV可以通过电压门控钙离子(CAV)介导的细胞内吞途径侵染昆虫sf9培养细胞[16]。紫外线照射5 min以上、高pH值(pH>8.5)，以及200 mg·kg-1的次氯酸钠、福尔马林、氯化苯甲烃铵等均可灭活病毒[17]。另外，自2009年起，在我国浙江、江苏、广西、广东等地罗氏沼虾苗种场，出现了一种幼体死亡综合征，给生产造成一定危害。从濒死的幼体中分离到病毒颗粒大小25～29 nm的新病毒，命名为MrTV。感染实验证实，该病毒是幼体死亡综合征的病原，基因组分析发现，该病毒是10 303 nt的单链RNA病毒，属于二顺反子病毒科Aparavius属[18]。

2 罗氏沼虾诺达病毒基因组及结构蛋白

MrNV是一种分节段RNA病毒，基因组为2条单链线性RNA，其中：RNA1长度约为3.1 kb，编码一个约110 ku的RNA聚合酶；RNA2约1.4 kb，编码42 ku的外壳蛋白。RNA1和RNA2均无poly(A)尾巴，且均已完成核酸序列测定，并在GenBank登录(登录号分别为AY222839、AY222840)。在病毒侵染细胞的细胞质中，还可以分离到一条约400 nt的亚基因组单链RNA3，其序列与RNA1的3’端一致，可编码非结构蛋白B2，B2蛋白具有抑制RNA干涉的作用[19]。在病毒粒子成熟装配时，RNA3不被装入病毒粒子中。从序列同源性分析，MrNV的病毒分类地位既不属于α-诺达病毒属，也不同于β-诺达病毒属，是一类新的诺达病毒成员[4]。XSV基因组为一条约900 nt的线性RNA链，XSV基因组不含编码RNA聚合酶的序列[20]。

MrNV及其卫星病毒XSV病毒粒子的蛋白组成较为简单。MrNV结构蛋白为43 ku(CP43)的单一蛋白，在肽链的20～29位残基中，80%的氨基酸残基带正电荷，是RNA结合域，如果以Ala残基替代这些带正电荷的氨基酸残基，则肽链失去RNA结合能力。同时，该区域与病毒组装无关，缺失RNA结合域的突变体仍能组装成病毒样颗粒[21]。XSV病毒颗粒含2条分别为16 ku(CP16)和17 ku(CP17)的多肽链，由同一个阅读框编码，CP16从第2个AUG起始密码子开始翻译，因此CP16为CP17的N端截短肽，而非CP17的酶解产物，两者按1∶1比例组成病毒外壳。缺失实验证明，肽链的C端序列是病毒外壳组装所必需的[22-23]。

3 罗氏沼虾白尾病病原的检测技术

罗氏沼虾病毒病在生产上目前尚无有效的防治方法，主要把加强病原监控、切断病原传播途径作为罗氏沼虾病毒病预防的首要手段[24]。对于罗氏沼虾诺达病毒，现已建立不同检测方法，如电镜检查、病毒核酸电泳、夹心Elisa法等，此外，还建立了点杂交[7]、原位杂交、胶体金试纸条法、环介导反转录等温扩增技术(RT-LAMP)[25]及双重反转录(RT)-PCR技术[24]等病毒检测技术。各种方法各有优缺点：胶体金试纸条检测法速度快捷，操作方便，但灵敏度较低；RT-PCR灵敏度高，但耗时较长，操作烦琐；RT-LAMP兼具快捷和灵敏度高的优点，生产上应用较广。

4 罗氏沼虾白尾病的免疫学防治

虾类是无脊椎动物，关于其抵抗外界病原体的免疫机制存在争议。长期以来，学者们认为无脊椎动物不存在后天适应形成的专一性免疫能力，一般认为，包括虾类在内的甲壳类动物应对病原体入侵的先天免疫系统包括体液免疫和细胞免疫[26]。在对虾抗白斑病的研究中，有多篇文献报道以外源表达的对虾白斑病病毒(WSSV)囊膜蛋白或核衣壳蛋白攻毒处理，可提高对虾抗WSSV的能力[27-31]，说明对虾在自然或实验条件下感染病毒后，可诱导类免疫反应。研究发现，以MrNV、XSV病毒分离混合液浸渍攻毒罗氏沼虾虾苗，可引起虾苗全部死亡，而浸渍攻毒或肌肉注射攻毒健康成虾，不会引起成虾死亡，且25 d后体内病毒即可被清除。成虾的许多免疫指标，如酚氧化酶原(proPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、总血细胞数(THC)、超氧化物阴离子、凝血时间、氧合血蓝蛋白等，攻毒处理后，在前期与对照相比发生显著差异，而后期则差异不显著[32]。另外，研究还发现，罗氏沼虾成虾对WSSV也有良好的抗性[33-34]，而幼虾则对WSSV敏感[35]，说明罗氏沼虾成虾具有更有效的防御反应。印度学者将外源表达的MrNV外壳蛋白浸渍处理虾苗24 h，或肌肉注射成虾，再用MrNV和XSV攻毒后，检测成虾免疫相关指标或虾苗免疫相关基因的表达情况，发现外壳蛋白处理可以诱导成虾多个免疫指标，如proPO、SOD及超氧阴离子(SOA)活性显著上升，虾苗免疫相关基因表达上调，处理组虾苗成活率大大提高[35]，说明罗氏沼虾的防御系统也可以被病毒粒子或病毒外壳蛋白诱导，发生类免疫反应。

MrNV病毒基因组RNA1编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。除参与病毒复制、调节病毒在宿主细胞中发育外，RdRp还是保持病毒稳定的靶蛋白，在外壳蛋白和其他亚单位RNA分子的合成中起作用，是病毒复制的关键蛋白。重组RdRp蛋白可以作为免疫诱导因子，刺激机体产生中和RdRp蛋白的免疫因子，抑制后代病毒RNA的合成[36]。肌肉注射重组RdRp可显著提高血细胞数，诱导免疫相关基因表达显著上调。注射重组RdRp并攻毒处理14 d后，病毒检测呈阴性，而对照组病毒检测呈阳性，说明外源RdRp处理后可以减少并逐步清除体内的病毒[37]。

RNA干扰是一种在进化过程中高度保守、由双链RNA诱发、造成同源mRNA特异性降解的现象，被证明是一种有效的防治对虾病毒病的方法[38]。利用细菌转录合成靶向MrNV外壳蛋白基因、B2基因，以及XSV外壳蛋白基因的双链RNA(dsRNA)，灭活细菌后，将灭活细菌包被到罗氏沼虾饲料上，通过口服的方式，添食单基因靶向或组合多基因靶向的dsRNA，添食24和72 h后，调查攻毒虾苗死亡率。结果显示，靶向病毒外壳蛋白基因的处理组存活率最高，而对照组虾苗全部死亡。说明RNA干扰机制在罗氏沼虾中可以工作，口服方式可以经济、有效地将dsRNA导入罗氏沼虾细胞并发挥作用[39]。

DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA(有时也可是RNA)，它可经一定途径进入宿主体内，被宿主细胞摄取后转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激机体产生非特异性和特异性2种免疫应答反应，从而起到免疫保护作用。DNA疫苗是防治对虾WSSV过程中很有效的一种疫苗，疫苗导入对虾后可引发有效的免疫保护反应[40]。用壳聚糖微粒包被含XSV反义基因的质粒，以口服或浸渍方法将质粒DNA导入罗氏沼虾体内，可有效提高染毒个体的存活率，显示DNA疫苗对罗氏沼虾病毒病有防效。通过分析包被微粒大小、微粒运载能力及体内质粒DNA的持续时间等指标，认为口服比浸渍处理能更有效地将质粒DNA导入宿主细胞[41]。

5 罗氏沼虾诺达病毒外壳蛋白用于制备病毒样微粒的应用

病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的空心颗粒。因VLP不含有病毒核酸物质，不能自主复制，因此也不具有感染性，又因其具有真病毒的衣壳空间构象，所以VLP又被称为“假病毒”或“伪病毒”，具有良好的生物安全性[42]。通过基因工程的方法，可对VLP的表面或内腔进行改造优化，使之具备更好的生物兼容性、更优的稳定性、更高的细胞摄入性，可用于药物的包被和高效运输[43]。研究发现，大肠埃希菌融合表达的MrNV外壳蛋白肽链，可在细菌细胞中自组装成与病毒颗粒结构相似的20面体[44]，同时，肽链N端富含碱性氨基酸残基区域易与带负电荷核酸结合，从而在组装过程中可将细菌核酸包裹进VLP微粒。在乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)和二硫苏糖醇(DTT)存在的条件下，MrNV VLP微粒结构发生解开；而在CaCl2存在时，肽链又可重新组装成微粒[45]。另外，虽然在肽链一级序列中有多个蛋白酶水解位点，但VLP微粒能在强水解条件下保持稳定，推测是肽链组装成微粒后的四元结构可保护潜在的水解位点免于水解蛋白酶的作用[45]。MrNV VLP的这些特性，使之十分适合作为生物胶囊，用于外源药物分子的包被与体内运输。

6 罗氏沼虾健康养殖策略

白尾病严重危害了罗氏沼虾养殖业的健康快速发展，在积极研制各种抗病药物的同时，设计罗氏沼虾健康养殖策略，开展养殖综合管理也极为重要[46]。

6.1 优质种苗培育

优质种苗是罗氏沼虾健康生产的基础，无病毒亲虾选育是优质种苗生产的关键。罗氏沼虾白尾病病原的流行病学调查表明，其主要的传播途径是亲虾携带和传播。通过对培育亲虾苗种定期进行病原检测，养殖全过程采取严格的消毒、隔离措施，制定严格的育苗区管理制度等措施，可以确保所选亲虾健康无病毒。另外，应在苗种繁育全过程中加强亲虾营养，在投喂饲料中添加复合维生素、免疫多糖等物质，提高亲虾的体质和免疫力。此外，在罗氏沼虾幼体阶段确保适宜的环境条件也是种苗培育中须加关注的[47]。