黄芪多糖提取方法研究进展

龚旭昊,张 璐,董玲玲,杨 星,范 强

(中国兽医药品监察所,北京 海淀 100081)

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根,是重要的补益中药。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是黄芪中最重要的天然有效成分,具有增强免疫功能、提高巨噬细胞活性、抗过氧化、抗菌、抗病毒及抗肿瘤、预防衰老及抗辐射、双向调节血糖等作用[1]。目前已作为免疫增强剂和抗病毒药物广泛应用于畜禽业中,而黄芪多糖相关制剂也已成为动物药业生产中首选的绿色兽药品种[2]。因此,研究和开发新的黄芪多糖提取方法,对养殖业病毒性疾病的防治研究,以及黄芪多糖相关产品及产业的开发和发展均具有重要的实际意义。黄芪多糖有多种提取方法,每种提取方法也各有其优缺点,为了更好地对其进行应用和开发,文章对近年来黄芪多糖提取方法的研究文献进行了综述,以期能提供一定的参考价值。

1 水提取法

1.1 水煎煮法 水煎煮法为黄芪多糖传统提取方法,又称为水提醇沉法,其是根据大多数多糖在热水中溶解度较大而在高浓度醇中溶解度小的性质进行提取。一般工艺流程为加8～12倍量水,煎煮2～3次,每次1～2 h,过滤,合并滤液,再经浓缩、醇沉等处理得到黄芪粗多糖。该方法的优点是工艺简单、操作方便、对多糖的破坏小,是目前应用最为广泛的黄芪多糖提取方法。徐青梅[3]对工艺进行了优化,最佳工艺条件为提取温度100℃,时间1 h,提取3次。李金芳[4]确定的最佳提取工艺为：提取时间45 min、提取温度100℃、料液比1∶10、提取次数3次,多糖提取率为10.35%。

虽然该方法简单易行,但也存在一些缺点：(1)多糖提取率及含量普遍较低；(2)提取温度高(100℃),且需要耗费大量有机溶剂,浪费能源和资源,经济效益较低；⑶对提取物的选择性不好,提取物成分类别较多,不利于后续的分离纯化,同时也容易变质。

1.2 水浸提法 采取水浸提法提取黄芪多糖,降低了提取温度,不但节约了能源消耗,提高了经济效益,而且可以提高提取的选择性及提取物的纯度。郝颖等[5]采用响应面法优化黄芪多糖的提取工艺,浸提温度95℃、浸提时间156 min、液料比29 mL/g、提取4次,在此条件下黄芪多糖的得率为13.20%,与预测值极为接近,工艺可靠。相较于传统水煎煮法,水浸提法更加环保、成本较低且适合生产。

1.3 水回流提取法 崔红花等[6]筛选出回流提取黄芪多糖的最佳提取工艺为：70℃恒温回流提取3次,每次3 h,固液比1∶40,黄芪多糖提取率达6.037%。刘杨等[7]回流提取的最佳工艺为：料液比1∶20；醇沉浓度 70%；回流提取 3次,每次50 min。

和传统水煎煮法相比,水回流提取法更加环保,节约资源,而且提取过程更为充分。

1.4 碱水提取法 黄芪多糖存在于黄芪纤维质中,因此其提取率和纤维质的溶胀作用及溶解性有着直接相关关系。在碱性条件下,一方面可使纤维的溶胀作用及溶解性得到显著增加,另一方面可使纤维之间的酯键更易发生断裂而发生剥皮反应,进而使更多的多糖以游离形式而被提取出来,进而提高多糖的提取率。刘永录等[8]采用NaOH水溶液提取法：取黄芪药材400 g,分别加12和10倍量pH值为12的NaOH水溶液煎煮2次,经后续处理,黄芪多糖提取率为7.73%,高于同试验进行的Ca(OH)2溶液提取率(7.12%),显著高于传统水提法提取率(3.64%)。另文作者还对不同pH值的CaO溶液提取黄芪多糖的效果进行了研究,发现pH值为9时,所得黄芪多糖提取率和纯度最高。

综述相关文献发现,碱水提取黄芪多糖多采用弱碱或稀碱溶液(pH值多为9～10),是为了避免强碱对多糖结构造成不良影响。虽然碱水提取法在提取率、产品纯度及经济效益方面都优于传统水提法,但该法提取过程所得滤液不易过滤和浓缩,一定程度上限制了其在实际生产中的应用。

1.5 醇除水提法许多学者对黄芪多糖前处理工艺进行研究后发现,通过对原料黄芪进行化学处理或生物学处理可显著提高多糖收率。而化学处理多为选用有机溶剂进行脱脂处理,以减少提取液中杂质含量。考虑到脱脂溶剂的毒性及可操作性,目前多采用高浓度乙醇脱脂。牟鲁霞等[9]采用3倍量95%乙醇对黄芪药材回流脱脂1.5 h后,加入8倍量水,在100℃下提取90 min,共提取3次,粗多糖提取率和以葡萄糖计的多糖得率平均为14.76%,4.78%。

醇除水提法已经深入结合到多数黄芪多糖提取方法中,即多数方法均先用高浓度乙醇溶液(80% ～95%)除去部分杂质后,再进行黄芪多糖的提取,以便于多糖后续的分离纯化等处理,使得到的产物纯度更高。

2 碱醇提取法

在碱水提取黄芪多糖的工艺基础上继续改进,采用碱醇提取,主要是基于碱溶液对植物细胞具有明显破壁作用,对植物纤维有明显溶胀及溶解作用,而醇溶液则有很强的渗透作用,在醇与碱的共同作用下,可以增加黄芪多糖的渗透率,降低多糖在植物组织中的残留量,从而达到提高提取率的目的。

田洛等[10]首次采用碱醇法提取黄芪多糖,筛选出黄芪多糖的最佳提取工艺,料液比1∶10,pH值=12的5%Na2CO3乙醇溶液,90℃提取90 min,多糖提取率为19.15%,高于本试验同样条件下碱水提取法(7.31%)、水提取法(5.47%)及相关文献报道的黄芪多糖的提取率,且提取残渣中有效成分含量较低,具有现实生产意义。金芬芬等[11]通过试验比较水提醇沉法、醇提后水提法、碱水提取法、碱醇提取法的提取效果,研究发现,4种提取方法中碱醇提取法提取率最高(9.74%),其后依次为碱水提取法(7.64%)、醇提后水提法(3.62%)、水提醇沉法(2.81%)。碱醇提取工艺为 pH值 =12的NaOH醇溶液,料液比1∶10,加热回流提取3次,时间分别为3 h、2.5 h、2 h。

该方法是一种基本实现产业化的方法,较传统提取方法,其多糖提取率较高,产品纯度及稳定性也较好。但该法对生产设备的要求相对较高,而且提取过程中产生的废水需要处理,进而增加了能源消耗。

3 微波提取法

微波具有穿透力强、选择性高、提取时间短、加热效率高等特点。微波提取法又称微波辅助提取技术,是一种将传统溶剂提取与微波结合而形成的提取方法,该技术于1986年首次用于有机物的提取[12]。在黄芪多糖的提取研究中采用微波进行辅助提取主要是基于微波的快速热效应能使细胞壁破裂,并使细胞膜中的酶失去活性,从而使细胞中的多糖成分更容易被提取出来,进而达到提高提取率的目的。

王莉等[13]首次采用微波技术提取黄芪多糖,将黄芪药材放于连续微波反应器中,通过有机溶剂脱脂、不断调整机器功率、以水回流提取等方式制备黄芪多糖,大大缩短了提取时间,同时也提高了多糖含量(6.55%),但对所得多糖的结构组成及结构是否发生变化未作研究。陈玉霞等[14]通过比较微波提取和水提醇沉法制备黄芪多糖的实验研究发现,微波提取法的黄芪多糖提取率为4.502%,含量为31.25%,均高于水提醇沉法的4.468%和29.40%。微波提取有着更高的提取率和多糖含量。

微波辅助提取缩短了提取时间,降低了溶剂损耗,较水提取法提取率有了明显提高。但是设备可操作性差,对提取物的选择性差,产品纯度相对较低,易变质,不易于后续处理。此外,微波是否会对黄芪多糖的结构、生物活性甚至药效等产生影响还有待深入研究。

4 超声提取法

作为一种新型的多糖提取技术,超声波提取黄芪多糖的原理主要基于以下两个方面[15]：(1)超声波处理加速了黄芪药材的溶胀及水合过程,有利于多糖通过渗透及扩散作用更快的转移到提取溶剂中；(2)超声波的空化作用可以破坏细胞壁及细胞膜的结构,有利于胞内多糖的快速溶出。

陈寿妮[16]通过4因素3水平的正交试验设计,确定超声提取的最优工艺为超声功率300 W,温度50℃,料液比1∶30,提取4次。所建立的方法快速简便,适用于黄芪多糖的提取。赵玉丛等[17]比较循环超声法和煎煮法提取黄芪多糖的区别,当提取时间40 min,提取功率1000 W,超声时间/间隙时间比值=1∶1时,多糖提取率最高可达11.44%,比传统煎煮法高3.38%。研究还通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)技术对两种提取法制得的黄芪多糖结构进行了研究,发现超声提取会引起黄芪多糖的结构发生一定变化,煎煮法对多糖结构没有明显破坏。分析其原因在于超声波会引起化学键断裂和原子重排,进而导致组成多糖的单糖分子结构发生改变,而分子结构的改变,也可能会对多糖的理化性质及生物活性产生一定影响。

与传统提取方法相比,超声波提取黄芪多糖具有提取率高、省时、节能、节省溶剂等优点,降低了提取成本。但该方法也有其局限性,一方面是所得多糖粗提物的总量少,且后续提取及药渣处理比较复杂；另一方面,其对黄芪多糖结构及生物活性的影响尚具不确定性,这也导致该方法在实际应用中没有得到大范围的推广。

5 超高压提取法

超高压提取技术是一种全新的天然产物有效成分提取技术,是指在常温下用100～1 000 MPa的流体静压力作用于料液上,保压一段时间后,迅速卸压,使细胞内外渗透压力差突然增大,破坏细胞的各种膜,进而达到提取的目的。此外,由于超高压提取是在常温下进行的,所以在提取黄芪多糖时,还可有效避免热效应导致其生物活性降低的问题。

刘春娟等[17]首次采用超高压技术提取黄芪多糖,其条件为：压力350 MPa,料液比1∶60,浸泡时间5 h,保压时间2 min,多糖提取率为24.28%。王再幸等[18]采用高压脉冲电场快速提取黄芪多糖,确立的最佳工艺为电场强度20 KV/cm,脉冲数为6,料液比1∶14,最终黄芪多糖得率为24.36%。

超高压提取法与传统提取方法相比,提取率得到明显提高,且具有时间短、耗能低、提取液杂质少、易分离纯化等优点,但一方面其对生产设备的要求相对较高,另一方面研究发现黄芪多糖的低温提取物重复药效并不好。该方法有待进一步的深入研究。

6 酶提取法

酶提取技术是近年来应用愈加广泛的一种植物有效成分提取的生物工程技术,其主要是利用酶具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点,将植物组织分解,加速有效成分的释放,进而提高提取率。中草药植物细胞壁大多由纤维素构成,黄芪药材中纤维素和半纤维素分别占25.63%、12.18%,二者共占了原料成分的37.81%,而经传统提取工艺提取过的药渣中主要是结构多糖且以纤维素含量最多。考虑到纤维素对黄芪多糖最大限度的溶出具有较大制约作用,且纤维素是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成,而纤维素酶能特异性的破坏β-1,4糖苷键,并且具有很高的穿透性,能进入细胞壁内部将其充分溶胀,在不破坏多糖成分的前提下将其充分溶出,进而提高提取率[19]。基于此,多选用纤维素酶作为黄芪多糖的辅助提取用酶。

闫巧娟等[20]首次将纤维素酶辅助提取工艺应用于黄芪多糖的提取,在对多糖含量影响不大的情况下,黄芪多糖得率的提高率达20%以上。纤维素酶的最佳处理条件为：加酶量60 U/g,酶处理时间90 min,处理温度50℃。通过扫描电镜观察结果发现,经纤维素酶处理后的药渣中的网状结构变得十分清晰,中间的多糖等物质得到了较为充分的溶出。张嘉怡等[21]报道酶添加量0.4%,酶解pH值4.2,酶解温度55℃,酶解时间90 min；水提温度100℃,水提时间1.5 h,料液比1∶12,提取3次。黄芪多糖提取率较传统水提法提高了54.05%。

研究发现,纤维素酶不改变提取传质动力学,仅破坏黄芪药材细胞壁,降低扩散阻力,使黄芪多糖的传质速率和有效扩散系数明显提高[22]。因此,酶法提取黄芪多糖,能减少提取时间,降低能源损耗,提高提取率,增强产品稳定性,且对环境无污染,具有非常广阔的发展前景。

7 联合提取及其他新方法

董玲玲等[23]采用纤维素酶酶解-微波法新工艺提取黄芪多糖,确立的最佳工艺条件为：酶料比57.6 U/g,pH值6.0,60℃下酶解60 min,料液比1∶10,微波功率480 W,提取2次,8 min/次,所得多糖提取率为16.07%,多糖质量分数达88.40%。优于文献报道的提取效果,且该方法具有耗时短、能耗低、提取率高、产物纯度高等优点,是一种较为理想的提取方法。杜广芬等[24]采用超声-微波联合提取工艺提取黄芪多糖,最佳提取条件为微波功率120 W,提取时间为150 s,料液比1∶25,黄芪多糖的提取率高于水提法、微波法及超声波法。贲永光等[25]采用超声联合纤维素酶法提取黄芪多糖,最佳工艺参数为：超声功率400 W,时间30 min,温度40℃,料液比1∶20,加酶量10 mg,酶解温度50℃,pH值4.5,酶解时间60 min。所得多糖的平均提取率为24.12%,工艺稳定可行。陈艳蕊[26]等建立了黄芪多糖的闪式提取技术工艺,提取温度65℃、提取时间2 min、pH 值为10、提取电机电压200 V、料液比1∶10、乙醇浓度为5%(V/V),所得黄芪多糖总量达到123.46 mg/g,比碱提法多糖得率提高了近30%。

研究文献发现,一些联合提取方法及其他一些新工艺,提取黄芪多糖的效率更高,值得进一步深入研究。

8 思考与展望

随着科技的进步和研究的深入,黄芪多糖的提取方法愈加丰富多彩,亦取得了很多的成果和突破。但每种方法都不是十全十美的,都有其优缺点,而评价一个提取方法是否优良,笔者认为可以从以下几个方面进行综合考虑：⑴黄芪多糖的提取率及纯度高低；⑵是否有利于多糖后续的分离纯化等处理；⑶提取工艺是否稳定可靠、简单方便、经济环保；⑷是否会对多糖的结构、生物活性及临床药效产生不利影响；⑸提取工艺用于实际生产的可行性及对生产设备和条件要求的高低。目前,水提取法仍是应用最多的一种方法,其工艺成本低、安全,适于工业化大生产,但较其他方法提取率相对较低,对提取物的选择性不好,产品纯度低、易变质,不利于后续的处理。碱醇提取法成本低、时间短、条件温和、提取率高,具有实际生产意义。现代提取方法,如微波、超声及超高压提取等,虽然总体上有更高的提取率,但因其对黄芪多糖结构和生理活性的影响具有不确定性及对生产设备的要求比较复杂等,一定程度上限制了它们在生产上大规模的应用。而纤维素酶提取法具有条件温和、节能环保,提取选择性高、省时、产品稳定等优点,经分析文献研究结果,发现其提取率较传统提取方法高出近2倍以上,经济效益较高,值得进一步深入研究和在实际生产中大力推广应用。

在综述文献时还发现,即便采用类似的或同一种提取方法,所得黄芪多糖提取率均有差异,有时差异甚至较大。这可能与研究人员所选用的黄芪药材品种、质量、所用溶剂的量及浓度、提取时间、温度、次数等具体技术参数有关。因此,若要得到更加稳定的工艺及结果,需要对提取过程中的诸多影响因素进行综合考虑并严格控制,建议制定相应的标准加以规范。

为黄芪多糖相关产品的开发提供更加优质、高效、经济、环保的原料是黄芪多糖提取方法研究的最终目的。虽然截止到目前,一些提取方法尤其是现代提取方法对黄芪多糖结构变化、稳定性、生理活性、成分组成及临床药效的影响有些还尚不清楚,还有待于进一步深入的研究。但我们相信随着技术的进步及研究的不断深入,已有工艺会不断得到优化,新技术亦会逐渐弥补已有工艺中的不足,新的更好的方法也会不断的被开发出来,进而对黄芪多糖相关产品及产业的开发和发展产生积极的促进意义。