基因组步移技术概述

高俊平

(山东省潍坊科技学院贾思勰农学院 潍坊 262700)

基因组步移(genomic walking)是指从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针，从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆含有与探针相重叠的序列。从第二个重组克隆再分离出末端小片段作为探针筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段。它是一种重要的分子生物学研究技术，可以有效克隆已知片段侧翼的未知序列。

迄今为止，基因组步移主要有两种方法： 一是结合基因组文库的基因组步移技术，此方法适于长距离步移，可以获得某一特定染色体较长连续区段的重叠基因组克隆群；另一个是以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增为主要手段的基因组步移技术，该方法产生的步移距离相对较短，但是操作简单，尤其适合于寻求已知片段旁侧的未知序列。

1 基于基因组文库的基因组步移技术

基因组文库是指生物体的全部DNA经过合适的核酸内切酶消化或机械切割以后，克隆到合适的载体分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，就包含了这个生物体的整个基因组信息，也就成为了此生物体的基因组文库。它是基因组学研究的重要技术平台，目前构建基因组文库的方法主要有两种： 物理剪切法和限制性内切酶法[1]。

以基因组文库为基础进行基因组步移的步骤大体如下： ①用与目的基因连锁的分子标记为探针筛选整个基因组文库，鉴定出分子标记所在的大片段克隆；②再以该克隆为基因组步移的起点，用外侧克隆末端作为探针筛选基因组文库，分离新的重叠克隆(阳性克隆)；③多次重复上述步骤，逐渐逼近目的基因，构建目的基因区域的重叠群；④通过亚克隆文库获得含有目的基因的小片段克隆，并对其进行遗传转化和功能互补验证，从而最终确定目的基因的核酸序列。

2 基于PCR技术的基因组步移技术

随着PCR技术的发明，以该技术为基础发展了多种基因组步移方法，这些方法按原理可分为两类： 一是依赖酶切连接介导的PCR法；二是不需要酶切连接的PCR法。

2.1 依赖酶切连接的PCR 此类方法首先对基因组DNA进行酶切，然后把酶切产物连接成环或在酶切产物末端加上相应的接头。根据已知序列设计的特异引物和接头上的锚定引物分别作为PCR反应的正反向引物，以此来扩增已知序列的上下游侧翼序列。

2.1.1 反向PCR 反向PCR(inverse PCR, IPCR)的原理是对已知序列进行限制性内切酶位点分析，然后选取已知序列中没有位点的限制性内切酶，对基因组DNA进行酶切并将酶切片段环化自连，然后根据已知序列设计反向引物，扩增已知序列两侧的未知序列。IPCR的优点是操作简单；缺点是环化过程难以控制，这是因为酶切位点随机分布，有可能产生较长的片段，从而导致PCR扩增效率下降。鉴于此，科研人员在此基础上发展了桥连IPCR： 环化的过程中，在酶切位点之间特意加上一段桥连片段，从而能更有效地扩增侧翼片段。Chen等[2]通过IPCR技术克隆了小麦花粉特异性基因TaPSG719的启动子序列。尽管IPCR应用不多，但它开创了利用PCR技术进行基因组步移的先河。以此为基础，大量应用PCR技术进行基因组步移的方法相继涌现。

2.1.2 载体PCR 载体PCR(single specific primer PCR, SSP-PCR)是指把基因组DNA酶切片段连接到质粒载体上，并用已知序列设计的特异引物和载体上的通用引物特异扩增目标片段的一种PCR技术。SSP-PCR实验设计简单，尤其适合于保存有cDNA或基因组文库的实验室，但是其操作较繁琐，特异性较低，产物仍需做进一步的鉴定。Gowik等[3]运用SSP-PCR技术成功克隆出了一种黄顶菊基因(ppcA1)的启动子序列。

2.1.3 连接单链接头的PCR 单链接头PCR(panhandle PCR, P-PCR)是连接单链接头PCR的典型代表，因其关键环节形成一个锅柄状结构，故也称锅柄PCR。其原理为： 基因组DNA先用限制性内切酶酶切，然后在酶切片段末端连接上含有自由端的单链寡核苷酸链(3′端与已知序列中部分片段完全反向互补)，这样含有连接片段的单链DNA在合适的温度下会自身退火形成一个类似锅柄结构的环，接下来用在已知序列内呈线性排列的3个单引物进行3次PCR扩增，即得到目的片段。P-PCR的优点是特异性较高，但由于单接头连接效率低，会限制锅柄结构的形成。在此基础上，科研人员对其进行了改进，即在形成锅柄之前在3′末端连接双脱氧胞苷三磷酸(ddCTP)，从而使引物错配的概率减少，特异性则相对增加。Shang等[4]运用改良的P-PCR技术从灵芝中成功克隆出了羊毛固醇合酶基因的启动子序列。

2.1.4 连接双链接头的PCR 双链接头PCR法主要原理为： 用能够产生黏性末端的限制性内切酶切割基因组DNA，将酶切好的DNA片段和退火双链接头用T4连接酶连接起来，最后通过一条特异性引物和一条根据接头序列设计的引物进行PCR扩增(有时需要进行巢式PCR)，即可获得包含有侧翼序列的片段。在实际运用过程中，科研人员根据具体情况发展出捕捉PCR(capture PCR)、抑制PCR(suppression PCR)、T接头连接的PCR(T-linker-specific ligation PCR, T-linker PCR)等多种步移方式。双链接头的PCR的优点是特异较好，但由于要进行基因组酶切，所以对基因组DNA的质量要求较高，而且步骤较为繁琐。笔者曾运用双链接头的PCR成功克隆了日本沼虾胰岛素样促雄性腺激素基因和胰岛素样促雄性腺激素结合蛋白基因的全基因组序列(含启动子区域和内含子区域)[5]。

2.2 非依赖酶切连接的PCR 酶切介导的PCR步移技术无疑都会受到酶切位点的限制，因此研究者开发了非依赖酶切连接的PCR技术，主要有以下几种：

2.2.1 新Alu-PCR Alu因子是一类仅存在于灵长类基因组中的短片段重复序列，平均大约每4 kb碱基就出现一次。研究者利用这一规律，发明了Alu-PCR。其原理是根据Alu的序列设计引物，来扩增两个Alu之间的片段区域。新Alu-PCR则是根据已知序列或是外源插入序列与Alu保守序列设计引物，扩增所需的未知侧翼序列。因Alu仅存在于灵长类，这也大大限制了Alu-PCR在其他物种的应用。

2.2.2 热不对称交错PCR 热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)是非酶连介导的PCR基因组步移技术的典型代表。其基本原理是根据已知序列区域设计三个具有高退火温度、较长的巢式特异引物，将它们分别和一个具有低退火温度、较短的(16 nt)任意简并引物(arbitrary degenerate primer, AD)配合使用，根据引物的长短和特异性差异设计不对称循环温度，并通过三级PCR反应得到目的产物。TAIL-PCR技术简单方便，反应高效灵敏，产物特异性高，多数情况下能够获得较为满意的结果，因而应用非常广泛，几乎适用于所有物种的基因组。例如，Song等[6]运用此方法从沙冬青中成功分离克隆了肌醇半乳糖苷合酶基因的启动子序列。但不容忽视的是，TAIL-PCR也存在AD引物结合位点有限导致扩增产物较短(一般情况小于1 kb)以及整体所需引物组合较多、反应条件设置要求比较精细等问题。鉴于此，科研人员对其进行了改进并建立了高效热不对称交错PCR技术(hiTAIL-PCR)。改进之处在于： 简并引物序列适当增长(LAD)为33～34 nt，而不是原来的16 nt，且LAD引物的5′端为用于第二轮PCR的基因特异引物SP2序列，这样就保证了扩增的特异性。因此，hiTAIL-PCR比TAIL-PCR扩增成功率更高，产物也更长(可达3 kb)[7]。

2.2.3 引物退火控制PCR 引物退火控制(DNA walking annealing control primer, DW-ACP)PCR策略的核心在于采用了复性控制引物(annealing control primer, ACP)。ACP有3部分组成，依次为： 3′端的目标核心序列、中间的调节序列和5′端的非目标尾部序列。目标核心序列能和待扩增区域的某一部位特异结合，但位置随机；非目标尾部序列主要起到调节整条引物Tm的作用；调节序列是其中关键部分，它能促进目标核心序列与模板特异性结合而抑制非目标尾部序列与模板的非特异性结合，从而阻碍非特异性扩增。该方法程序较为简单，扩增特异性高，不足之处在于： ACP引物受专利保护，3′端的目标核心序列尚未公开。Harreither等[8]运用此方法从真菌中分离了纤维二糖脱氢酶基因组全长序列。

3 总结与展望

虽然测序技术飞速发展，但当前某一物种的全基因组测序价格仍然异常昂贵，因此，基因组步移仍旧是获取基因组DNA序列的首选途径。以上介绍的几种技术是典型的基因组步移方法，每种方法都有其优点和局限性。根据笔者的经验，在具体的实验实际操作中，可以通过几种方式联合起来进行基因组步移，从而有效地获取目的基因。同时，随着分子生物学和基因工程技术的发展，更高效基因组步移方法的出现指日可待。