猴头菌-青蒿生物转化物化学成分的研究

2019-01-11赵小芳何述金李顺祥

中成药 2019年8期

赵小芳，徐博，任杰，何述金，李娟，3*，李顺祥，3*

（1. 湖南中医药大学，湖南长沙410208； 2. 湖南新汇制药股份有限公司，湖南长沙410200； 3. 湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心，湖南长沙410208）

猴头菌丝体为齿菌科真菌猴头菌Hericium erinaceus （Bull.） Pers. 经固体发酵而得到的菌丝体干燥粉末, 具有利五脏、健脾益胃、降胆固醇、滋补等功效。青蒿为菊科艾属植物黄花蒿Artemisia annua L. 的干燥地上部分[1], 《滇南本草》中始载“青蒿, 味苦, 性寒, 入脾胃, 去湿热”。本课题在猴头健胃灵片[1]研究基础上, 将猴头菌丝体创新性地接种于含青蒿药材粉的培养基中制得猴头菌-青蒿生物转化物[2]。喻凯等[3]从猴头菌丝体中分离得到的蒽醌类具有抗幽门螺杆菌活性, 课题组前期研究发现其提取物乙酸乙酯部位抑制抗幽门螺杆菌效果最好, 故对该部位化学成分展开研究, 前期已对10 个化合物进行了报道[4], 现又分离鉴定10 个化合物。

1 材料

超高效液相色谱串联四级杆/飞行时间质谱仪（美国Waters 公司）； AVANCE ⅢHD 600 型核磁共振波谱仪（德国布鲁克公司）； BSA 124S-CW 分析天平（深圳市华恒仪器有限公司）； JHBE-50T闪式提取器（河南智晶生物科技发展有限公司）；Sephadex LH-20 （美国Pharmacia 公司）；薄层硅胶GF254和柱层析用硅胶（青岛海洋化工厂）。所有试剂均为分析纯。

猴头菌-青蒿生物转化物于2015 年12 月11 日由湖南新汇制药股份有限公司提供, 标本保存于湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心。

2 提取与分离

取猴头菌-青蒿生物转化物47.2 kg, 粉碎, 12倍75%乙醇闪式提取6 min, 过滤, 提取液减压浓缩至无醇味, 等体积乙酸乙酯萃取3 次, 萃取液减压浓缩得乙酸乙酯部位440 g。乙酸乙酯部位经硅胶柱层析, 石油醚-乙酸乙酯（100 ∶1 ～0 ∶1）梯度洗脱, 得17 个组分Fr.A ～Fr.Q。其中, Fr.A（15.80 g）经硅胶柱, 石油醚-乙酸乙酯（50 ∶1 ～1 ∶1）梯度洗脱, 得6 个组分Fr.A1-A6, Fr.A3（1.34 g）经硅胶和Sephadex LH-20 柱得化合物1（5.1 mg）； Fr.I （11.24 g）经硅胶柱, 石油醚-乙酸乙酯（10 ∶1 ～1 ∶1）梯度洗脱, 得3 个组分Fr.I1～I3, Fr.I2 （8.13 g）经硅胶反复柱层析分离得化合物3 （15.3 mg）、 9 （30.2 mg）、 10 （4.8 mg）, Fr.I3 （1.62 g）经硅胶柱分离得化合物6（1.4 mg）； Fr.J 和Fr.K 合并为Fr.JK （25.76 g）经硅胶柱, 石油醚-乙酸乙酯（10 ∶1 ～1 ∶1）梯度洗脱, 得5 个组分Fr.JK1-JK5, Fr.JK4 （5.60 g）经硅胶反复柱层析分离得化合物4 （47.2 mg）、 5（190.9 mg）, Fr.JK5 （4.01 g）经硅胶柱减压层析, 石油醚-乙酸乙酯（10 ∶1 ～1 ∶1）梯度洗脱,得化合物7 （12 mg）、 8 （4.3 mg）； Fr.L （62.35 g）经硅胶柱, 二氯甲烷-甲醇（50 ∶1 ～1 ∶1）梯度洗脱, 得8 个组分Fr.L1-L8, Fr.L5 （9.87 g）经二氯甲烷-甲醇（20 ∶1 ～3 ∶1）梯度洗脱, 重结晶得化合物2 （285.6 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：无色针晶（乙酸乙酯）, HR-ESIMS m/z： 415.393 0[M+H]+（计算值415.394 0）,分子式C29H50O。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ：1.00 （3H, s, CH3-19）, 0.91 （3H, d, J=6.5 Hz,CH3-21）, 0.84 （9H, m, 26, 27, 29-3CH3）, 0.68（3H, s, CH3-18）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ：38.7 （C-1）, 38.4 （C-2）, 212.5 （C-3）, 44.9（C-4）, 46.9 （C-5）, 29.1 （C-6）, 31.9 （C-7）,35.6 （C-8）, 53.9 （C-9）, 35.8 （C-10）, 21.6（C-11）, 40.0 （C-12）, 42.7 （C-13）, 56.3 （C-14）, 24.4 （C-15）, 28.4 （C-16）, 56.4 （C-17）,12.2 （C-18）, 11.6 （C-19）, 36.3 （C-20）, 18.9（C-21）, 34.0 （C-22）, 26.2 （C-23）, 46.0 （C-24）, 29.3 （C-25）, 20.0 （C-26）, 19.2 （C-27）,23.2 （C-28）, 12.1 （C-29）。以上数据与文献[5] 基本一致, 故鉴定为5α-豆甾-3-酮。

化合物2：白色片状结晶（氯仿）, TLC 10%硫酸乙醇显色为暗绿色, HR-ESI-MS m/z：431.352 5 [M+H]+（计算值431.352 5）, 分子式C28H46O3。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 5.35（1H, m, H-7）, 5.23 （1H, dd, J=15.2, 7.6 Hz,H-23）, 5.16 （1H, dd, J=15.2, 8.2 Hz, H-22）,4.08 （1H, m, H-3）, 3.62 （1H, s, H-6）, 2.15（2H, m, H-4）, 2.04 （2H, m, H-12）, 1.09（3H, s, H-19）, 1.03 （3H, d, J = 6.5 Hz, H-21）, 0.92 （3H, d, J = 6.8 Hz, H-28）, 0.84（3H, d, J=6.4 Hz, H-26）, 0.82 （3H, d, J=6.5 Hz, H-27）, 0.60 （3H, s, H-18）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ： 33.1 （C-1）, 31.0 （C-2）, 67.9（C-3）, 39.6 （C-4）, 76.1 （C-5）, 73.8 （C-6）,117.7 （C-7）, 144.2 （C-8）, 43.6 （C-9）, 37.3（C-10）, 22.2 （C-11）, 39.4 （C-12）, 43.9 （C-13）, 54.9 （C-14）, 23.0 （C-15）, 28.1 （C-16）,56.1 （C-17）, 12.5 （C-18）, 19.0 （C-19）, 40.6（C-20）, 21.3 （C-21）, 135.5 （C-22）, 132.3（C-23）, 43.0 （C-24）, 33.2 （C-25）, 20.1 （C-26）, 19.8 （C-27）, 17.7 （C-28）。以上数据与文献[6] 基本一致, 故鉴定为（22E, 24R）-啤酒甾醇。

化合物3：白色针晶（氯仿）, HR-ESI-MS m/z：283.154 9 [M+H]+（计算值283.154 5）, 分子式C15H22O5。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 5.64（1H, s, H-5）, 3.63 （1H, brs, H-3β）, 3.21（1H, m, H-11）, 2.07 （1H, dt, J=13.3, 4.4 Hz,H-7）, 1.54 （1H, m, H-1）, 1.50 （1H, m, H-2β）, 1.99 （1H, m, H-2α）, 1.82 （1H, m, H-9α）, 1.12 （1H, m, H-9β）, 1.94 （1H, m, H-8α）, 1.02 （1H, m, H-8β）, 1.30 （1H, m, H-10）, 1.58 （3H, s, CH3-15）, 1.21 （3H, d, J=7.2 Hz, CH3-13）, 0.94 （3H, d, J=6.4 Hz, CH3-14）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ： 40.7 （C-1）,30.5 （C-2）, 69.2 （C-3）, 109.0 （C-4）, 99.1（C-5）, 83.1 （C-6）, 42.2 （C-7）, 23.7 （C-8）,33.5 （C-9）, 35.3 （C-10）, 32.9 （C-11）, 171.5（C-12）, 12.7 （C-13）, 18.6 （C-14）, 20.7 （C-15）。以上数据与文献[7-8] 基本一致, 故鉴定为3α-羟基脱氧青蒿素。

化合物4：黄色棒状结晶（甲醇）, TLC 紫外灯（365 nm）下检视呈蓝色荧光, HR-ESI-MS m/z：193.049 4 [M+H]+（计算值193.050 1）, 分子式C10H8O4。1H-NMR （600 MHz, CD3OD） δ： 7.85（1H, d, J=9.4 Hz, H-4）, 7.10 （1H, s, H-5）,6.76 （1H, s, H-8）, 6.20 （1H, d, J=9.4 Hz, H-3）, 3.90 （3H, s, 7-OCH3）；13C-NMR （150 MHz,CD3OD） δ： 164.2 （C-2）, 110.1 （C-3）, 147.2（C-4）, 104.1 （C-5）, 153.0 （C-6）, 146.3 （C-7）, 112.7 （C-8）, 151.5 （C-9）, 112.7 （C-10）,57.0 （7-OCH3）。以上数据与文献 [9] 基本一致, 故鉴定为异莨菪亭。

化合物5：白色针晶（甲醇）, TLC 紫外灯（365 nm）下检视呈亮紫色荧光, HR-ESI-MS m/z：247.096 6 [M+H]+（计算值247.097 0）, 分子式C14H14O4。1H-NMR （600 MHz, CD3OD） δ： 7.87（1H, d, J=9.5 Hz, H-4）, 7.42 （1H, s, H-5）,6.74 （1H, s, H-8）, 6.21 （1H, d, J=9.5 Hz, H-3）, 4.77 （1H, t, J=8.7 Hz, H-2′）, 4.59 （1H,s, 4′-OH）, 3.26 （2H, m, H-3′）, 1.31 （3H, s,CH3-5′）, 1.25 （3H, s, CH3-6′）；13C-NMR （150 MHz, CD3OD） δ： 163.6 （C-2）, 112.0 （C-3）,146.2 （ C-4）, 124.9 （ C-5）, 127.2 （ C-6）,165.2 （C-7）, 98.0 （C-8）, 156.8 （C-9）, 113.9（C-10）, 92.4 （C-2′）, 30.1 （C-3′）, 72.2 （C-4′）, 25.2 （C-5′）, 25.2 （C-6′）。以上数据与文献[10] 基本一致, 故鉴定为nodakenetin。

化合物6：白色针晶（氯仿）, TLC 紫外灯（365 nm）下检视呈亮紫色荧光, HR-ESI-MS m/z：247.096 8 [M+H]+（计算值247.097 0）, 分子式C14H14O4。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 7.63（1H, d, J=9.4 Hz, H-4）, 6.79 （1H, d, J=8.5 Hz, H-6）, 6.24 （1H, d, J=9.4 Hz, H-3）, 3.92（1H, t, J= 5.0 Hz, H-3′）, 3.14 （1H, dd, J =17.6, 4.9 Hz, H-4′）, 2.98 （1H, dd, J = 17.6,5.2 Hz, H-4′）, 1.42 （3H, s, CH3-2′）, 1.35（3H, s, CH3-2′）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ：161.5 （ C-2）, 156.5 （ C-7）, 153.8 （ C-9）,144.1 （ C-4）, 126.8 （ C-5）, 114.5 （ C-3）,112.7 （ C-6）, 112.4 （ C-8）, 107.6 （ C-10）,78.2 （C-2′）, 68.6 （C-3′）, 22.4 （C-4′）, 26.0（C-5′）, 24.8 （C-6′）。以上数据与文献[11] 基本一致, 故鉴定为（+）-lomatin。

化合物7：黄色粉末（乙酸乙酯）, TLC 紫外灯（365 nm）下检视呈黄色荧光, HR-ESI-MS m/z：347.114 1 [M-H]-（计算值347.113 1）, 分子式C18H20O7。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 8.13（1H, d, J=9.8 Hz, H-4）, 7.64 （1H, s, H-2′）,7.02 （1H, s, H-3′）, 6.29 （1H, d, J=9.8 Hz,H-3）, 4.60 （1H, d, J = 10.1 Hz, H-3″）, 4.27（1H, m, H-2″）, 4.19 （3H, s, 5-OCH3）, 3.49（3H, s, 4″-OCH3）, 1.32 （3H, s, CH3-4″）, 1.28（3H, s, CH3-4″）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ：160.4 （ C-2）, 113.0 （ C-3）, 139.7 （ C-4）,145.0 （C-5）, 60.9 （5-OCH3）, 114.7 （C-6）,150.3 （ C-7）, 127.0 （ C-8）, 144.1 （ C-9）,107.6 （C-10）, 145.4 （C-2′）, 105.5 （C-3′）,76.2 （C-2″）, 76.1 （C-3″）, 71.7 （C-4″）, 25.2（C-5″）, 26.8 （C-6″）, 51.0 （4″-OCH3）。以上数据与文献[12] 基本一致, 故鉴定为（+）-tert-Omethylbyakangelicin。

化合物8：黄色针晶（甲醇）, HR-ESI-MS m/z：329.070 4 [M-H]-（计算值329.066 2）, 分子式C17H14O7。1H-NMR （600 MHz, CD3OD） δ： 7.26（2H, brs, H-2′, 6′）, 6.68 （1H, s, H-3）, 6.50（1H, s, H-6）, 6.22 （1H, s, H-8）, 3.96 （6H,s, 2CH3）；13C-NMR （150 MHz, CD3OD） δ： 166.1（C-2）, 104.6 （C-3）, 183.9 （C-4）, 163.3 （C-5）, 100.2 （C-6）, 166.1 （C-7）, 95.1 （C-8）,159.5 （ C-9）, 104.6 （ C-10）, 122.7 （ C-1′）,105.3 （C-2′, 6′）, 149.7 （C-3′, 5′）, 141.2 （C-4′）, 57.1 （3′, 5′-OCH3）。以上数据与文献[13]基本一致, 故鉴定为5, 7, 4′ -三羟基-3′, 5′-二甲氧基黄酮。

化合物9：黄色针晶（氯仿）, TLC 紫外灯（254 nm）下检视显暗斑, 10%硫酸乙醇显色为黄色, HR-ESI-MS m/z： 389.123 0 [M+H]+（计算值389.123 6）, 分子式C20H20O8。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 12.60 （1H, s, 5-OH）, 7.72（1H, dd, J=8.5,1.5 Hz, H-6′）, 7.68 （1H, d, J=1.5 Hz, H-2′）, 6.99 （1H, d, J= 8.5 Hz, H-5′）, 6.50 （1H, s, H-8）, 3.97 （6H, s, 3′, 4′-OCH3）, 3.96 （3H, s, 7-OCH3）, 3.92 （3H, s,6-OCH3）, 3.86 （3H, s, 3-OCH3）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ： 156.0 （C-2）, 139.0 （C-3）,179.0 （ C-4）, 152.9 （ C-5）, 132.4 （ C-6）,158.9 （C-7）, 90.5 （C-8）, 152.5 （C-9）, 106.7（C-10）, 123.0 （C-1′）, 111.4 （C-2′）, 148.9（C-3′）, 151.5 （ C-4′）, 111.0 （ C-5′）, 122.3（C-6′）, 60.3 （3-OCH3）, 61.0 （6-OCH3）, 56.5（7-OCH3）, 56.1 （3′-OCH3）, 56.2 （4′-OCH3）。以上数据与文献 [14] 基本一致, 故鉴定为蒿黄素。

化合物10：黄色针晶（氯仿）, TLC 紫外灯（254 nm）下检视显暗斑, 10%硫酸乙醇显色为黄色, HR-ESI-MS m/z： 375.107 3 [M+H]+（计算值375.108 0）, 分子式C19H18O8。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 12.59 （1H, s, 5-OH）, 7.72（1H, dd, J=8.6, 2.3 Hz, H-6′）, 7.68 （1H, d,J=2.3 Hz, H-2′）, 6.96 （1H, d, J=8.6 Hz, H-5′）, 6.50 （1H, s, H-8）, 3.99 （3H, s, 4′-OCH3）, 3.95 （3H, s, 7-OCH3）, 3.92 （3H, s,6-OCH3）, 3.87 （3H, s, 3-OCH3）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ： 155.8 （C-2）, 139.1 （C-3）,179.1 （ C-4）, 152.9 （ C-5）, 132.4 （ C-6）,158.9 （C-7）, 90.5 （C-8）, 152.5 （C-9）, 106.7（C-10）, 123.7 （C-1′）, 114.5 （C-2′）, 145.7（C-3′）, 148.9 （ C-4′）, 110.5 （ C-5′）, 121.7（C-6′）, 60.3 （3-OCH3）, 61.0 （6-OCH3）, 56.5（7-OCH3）, 56.2 （4′-OCH3）。以上数据与文献[15] 基本一致, 故鉴定为quercetagetin-3, 7, 3′,4′-tetramethyl ether。