中药微生物转化研究进展

侯亚男 冯昆

摘要：中药迎来现代化，既是机遇，也是挑战。微生物转化定义为指微生物在代谢过程中产生的一類或一系列酶对底物的催化或修饰反应。微生物转化可以将现代生物技术的优点和传统中药的优势融合在一起，通过氧化还原，糖基化，羟基化，水解等主要反应对中药活性成分进行修饰，产生新物质，增效减毒，降低成本，改善生物利用度等。尽管微生物转化拥有种类繁多，条件温和，酶系丰富等优势，但是也存在菌种选育困难，特异性差，盲目性大等缺点。笔者对微生物转化技术在中药领域的应用以及该技术的优缺点进行综述，以期为其广泛应用提供依据。

关键词：中药;微生物转化;酶反应;减毒增效;反应类型

中图分类号：R28  文献标志码：A  文章编号：1007-2349（2019）12-0066-04

中药是我国传统特有药物，历经了几千年的传承与发展。近年来，随着中药对各种疾病的预防与治疗作用的显现，使得中药及其活性成分成为全世界研究的热点之一。而中药现代化战略的逐步推行，让中药发展迎来了新一轮的挑战与机遇[1]。利用生物催化技术可将现代生物技术与传统中药的优势整合到一起，是中药现代化的实现过程中一种有效的手段。生物催化是指将天然存在的或人工合成的化合物作为底物，添加到处于对数生长期的微生物中，并在合适的条件下培养一定时间，使得底物与全细胞中的酶系发生相互作用，从而产生结构改变[2]。生物催化的主要技术之一便是微生物转化。微生物种类多、数量大，底物特异性强，在进行生物转化时反应条件温和、操作简单、产品纯度高、无环境污染。最早的微生物转化是使用环境中野生的微生物来发酵酿酒。此后，在发酵过程中进一步添加中草药，以促进微生物的生长和繁殖，进而得到了可以使用的各种药曲[3]。在上世纪 80 年代期间，研究的重点定位于单一微生物发酵，主要是微生物进行自身的发酵以产生次生代谢产物的过程，如冬虫夏草菌丝体以及灵芝菌丝体等。然而如今研究的重点已经从单味药或单一成分转变至复方成分，且已经有相应的中药产品应用于临床，如对麝香、三七、蛇胆和牛黄等中药进行微生物转化而得到的中成药片仔癀[4]。笔者以近五年的最新研究进展为基础对微生物转化在中药上的应用以及其涉及的主要化学反应进行综述，并对微生物转化技术的优缺点进行总结，以期为微生物转化的进一步研发应用提供依据。

1 微生物转化在中药上的应用

1.1 增加天然活性先导化合物来源 天然活性先导化合物是指由微生物或动植物在代谢过程中产生的一大类天然化合物。虽然其结构新颖、拥有一定的生理活性，但是也具有活性弱、特异性低、毒副反应明显、体内代谢不合理等缺陷导致不能直接药用。通过微生物转化技术来修饰天然活性先导化合物，一方面优化已知先导化合物的生物学性质，另一方面获得新的先导化合物。王照华[5]使用刺孢小克银汉霉（Cunninghamella echinulata）和日根霉（Rhizopus japonicus）对厚朴酚、和厚朴酚进行转化，得到了17个新的化合物，对获得先导化合物有重要意义。Han等[6]发现，通过蓝色犁头霉（Absidia coerulea）对补骨脂素进行微生物转化后得到三种代谢物，其中两种为新的黄烷酮化合物。

1.2 增强中药药效 中药经微生物转化后可提高药效，其作用机理是提高其有效成分的含量及比例，或是其有效成分与微生物在转化过程中产生的次级代谢产物发生了协同作用。石凤敏等[7]用灵芝菌对茯苓的微生物转化研究显示，茯苓不仅对灵芝菌生长具有促进作用，并且灵芝菌总多糖和总三萜的含量显著增加。Yang等[8]发现，利用光合细菌（Phtosynthetic bacteria）对槲寄生的活性成分进行转化后，槲寄生在体内和体外的抗肿瘤活性效果都得到显著的提升。

1.3 降低毒性 某些中药的毒副作用大大的影响了其在临床上的使用。通过安全性较高的药用真菌对中药进行微生物转化可以分解中药里的有毒物质，从而达到降低毒性的效果。马兜铃酸A因较强的肾毒性及致癌性而限制了马兜铃属的使用，曹艺等[9]发现，通过枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对马兜铃酸A生物转化，可降低该物质的含量。有研究发现，以灵芝菌株作为发酵真菌、生川乌为药性基质，经固体微生物转化后，酵制川乌呈低弱的毒性和更为显著的抗肿瘤活性[10]。除此之外，谢少朵等[11]从雷公藤茎中分离出4株对雷公藤提取物具有转化活性的菌株，以达到增效减毒的效果。

1.4 改善生物利用度 大部分中药被制为汤剂经口服进入体内后，其有效成分被肠道微生物转化，成为药理活性更强、生物利用度更高的代谢产物。柚皮素是柚皮苷的苷元，具有抗菌、抗炎和抗癌等生物活性。陈静等[12]从健康人肠道微生物菌群中分离出四株能将柚皮苷高效转化为柚皮素的菌株。杨艳等[13]发现，肠道微生物酶可转化多酚成为小分子酚酸，后者能被肠道直接吸收，显著提高了多酚的生物利用度。桑尚源等[14]发现，在肠道微生物的作用下，大豆皂苷Ⅱ被转化为大豆皂苷Ⅳ，最终被转化为大豆苷元B，这一过程表明其糖基被逐步水解成相对分子量更小，更易被吸收的代谢物。

1.5 降低成本 随着基因工程和微生物工程的快速发展，也带动了微生物转化技术的进步，酶的大量体外表达已经成为可能，这便使得药物生产所用的成本进一步降低。郑晨等[15]利用黑曲霉JH-2菌株微生物转化灯盏乙素得到野黄芩素，该酶转化产物降解性低弱，专一性较高，并且能显著提高野黄芩素的转化得率和产率，避免了现有野黄芩素生产方法的不足，具有一定的应用价值。此外，梅建凤等[16]选育出一株桔青霉（Penicillium citrinum）LB菌株，能转化连翘苷为连翘素，其转化率高达94.1%，具有方法简便、产物易纯化、副产物少和成本较低等优点。本课题组运用灵芝菌对参芪药渣进行生物转化后制得生物饲料添加剂，能显著提高家禽的抗氧化能力，既解决了中药渣存在的浪费问题，又降低了饲料的生产成本。

1.6 建立中药药代动力学研究的体外模型 某些中药的有效成分在微生物中的轉化途径不仅与在哺乳类动物体内的代谢机制类似，而且其转化所得产物的分离纯化过程相对简单。因此，微生物转化体系有助于中药代谢产物的微量甚至痕量分析，为药物体内代谢研究及毒理学的体外模型构建提供科学依据。实验研究表明，将大鼠肠道菌群和小檗碱进行体外厌氧共培养，通过一系列反应后，小檗碱被转化为小檗红碱，药根碱等5种代谢产物[17]。周立华[18]发现，短刺小克银汉霉（Aureobasidium blakesleeana）可将雷诺嗪转化为羟基化雷诺嗪、雷诺嗪硫酸酯结合物等9种代谢产物，此转化结果与哺乳动物体内代谢的结果相似，故可作为哺乳类动物代谢的体外模型。

2 微生物转化主要反应类型

微生物在转化过程中常对中药有效成分分子结构中的糖苷基、羟基、酰基等主要基团进行修饰。由于微生物的酶系丰富，且具有特异性，因此可以对同一化合物进行不同位点、不同基团的结构修饰，从而得到更多的衍生化合物。例如，环化酶诱导环化反应的发生，通过改变结构来增强活性;糖基化酶催化底物产生糖化反应形成糖苷键;羟基化酶可特异性的在反应底物的特定基团上插入羟基。除此以外，大部分微生物体内含有多种酶系，能诱导多种类型的反应发生，获得一系列的相关衍生物。如短刺小克银汉霉在对不同的底物进行微生物转化时能催化不同的反应类型（见表1），以期产生不同的效果。

2.1 氧化还原反应 柠檬烯是一种天然的功能性单萜化合物，在临床上可用于利胆，溶石，祛痰，以及治疗癌症，主要存在于植物精油中。因此台亚楠等[22]通过微生物转化柠檬烯来获得含氧衍生物，进而制备单萜芳香产品。此外，利用棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）产生的氧化还原酶对甜菊糖进行生物转化使之成为甜菊醇，后者是甜菊糖的苷元，结构为对映-贝壳杉烯型四环二萜，是新药研究的骨架之一[23]。

2.2 水解反应 薯蓣皂苷素是甾体激素工业中的重要起始物质，具有抗炎、抗癌以及避孕等多种生物活性。马迎迎等[24]发现薯蓣皂苷元能通过利用赤霉菌（Gibberella intermedia）WX-12转化薯蓣皂苷获得，分离纯化出该菌株的糖苷酶后发现其只能水解甾体皂苷上C-3位的糖苷键。ZHOU等[25]通过拟青霉（Paecilomyces bainier）sp.229从人参皂苷Rb1的放大发酵中纯化出三种化合物，分别是已知的3-酮衍生物和两种新的脱氢代谢物。此外，姚磊等[26]发现纳豆菌能将汉黄芩苷和黄芩苷中的β-葡萄糖醛酸水解成生成汉黄芩素和苷元黄芩素。

2.3 糖基化反应 微生物转化产物的生物活性经糖基化修饰后会得到优化，如转变为水溶性、结合态化合物，从而进一步提高其生物利用度。盖晓红等[27]以二氢去氢双松柏醇为反应底物，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为转化菌株将底物完全转化，得到二氢去氢双松柏醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等三种转化产物。α和γ-mangostin是山竹果皮中主要的氧杂蒽酮类化合物，生物活性显著，但是其水溶性较差，导致生物利用度低，贺峦[21]选用短刺小克银汉霉（Aureobasidium blakesleeana）对其进行微生物转化，得到四个化合物均为新的氧杂蒽酮类衍生物，且微生物转化均为发生在底物C3位上的特异性糖基化反应。此外，林福建[28]使用花斑曲霉（Aspergillus versicolor）优化人参三醇型皂苷以及人参二醇型皂苷特定位点上的糖基结构，使得含量相对较高的人参皂苷糖基被定向转化为稀有人参皂苷或苷元。

2.4 羟基化反应 马媛等[19]通过丝状真菌短刺小克银汉霉（Aureobasidium blakesleeana）CGMCC-3.970对甘草次酸进行微生物转化研究，获得3-酮基-15α-羟基-18β-甘草次酸（1）等6个产物，暗示短刺小克银汉霉对甘草次酸具有选择性酮基化及羟基化作用。香青藤中含有大量的阿朴菲生物碱，董建伟等[29]采用克隆氏菌（Clonostachys rogersoniana）发酵后能够转化为相对应的4R-羟基阿朴菲生物碱。此外，丁中涛等[30]也发现通过Clonostachys sp.发酵可完全转化荷包牡丹碱成为（4S，6aR）4羟基荷包牡丹碱。

3 微生物转化的优势与不足

3.1 微生物转化的优势 微生物的大量存在带来了丰富的酶，其反应条件温和，反应类型广泛，在转化中药上具有独特的优势，具体如下：（1）微生物种类繁多，可供大规模地筛选。（2）微生物在生活史中会产生各种各样的酶，包括蛋白水解酶、甘油酯水解酶、淀粉酶、纤维素酶、木质素酶等，这些酶系是高效生物催化体系的核心物质，多用于催化一些难以进行化学合成的反应。（3）微生物转化具有高度反应特异性，对映体特异性和区域特异性。（4）利用微生物转化技术来改变反应底物特定官能团时不需要对其他基团进行保护，显示出极高的选择性。（5）微生物转化所需要的反应条件十分温和。一般在中性pH，室温，常压下即可完成反应，使中药的有效成分在转化过程中得到保护，能有效的打破中药在传统制备过程中无法完全提取有效成分的局限。（6）通过优化转化条件能提高产率和转化率。一方面可适当添加诱导物、底物、表面活性剂、酶抑制剂，另一方面调整微生物在生长代谢过程中所需的能量比例，以此来解决在转化中药时遇到的某些成分溶难溶、底物和产物抑制酶活性、副产物多、产物被生物降解等难题。此外，微生物转化中药的反应可连续进行[31]。（7）可进行氧化、环氧化、还原、羟基化、酮基化、酰基化、烷基化、糖基化、酯化、水解等多种类型的反应，产生新物质并且为中药活性成分结构修饰提供新途径。（8）合理利用中药，节省药材资原，一般不会对环境造成污染。（9）很大程度上推动了中药现代化的进程和新药的开发，尤其是在改进中药剂型、提高中药疗效等方面提供了新的思路和技术手段，符合中药发展战略。

3.2 微生物转化的不足 由于中药现代化历程尚为短暂，且中药成分复杂，使得微生物转化中药仍然处于研究初期阶段，并存在一些需要改进的不足之处。（1）菌种的选育与分离筛选是中药微生物转化生产的基础和关键。自然界分离筛选的效率低下。（2）现阶段的微生物转化尚具有较大的盲目性。微生物转化主要是通过底物与微生物混合体系发酵进行生物转化，这个过程变量多、体系复杂、难以进行分解研究，在合成上无法进一步阐述真正催化化学反应的酶系特点。（3）特异性差。若菌株发生变异，酶系类型也可能发生变化。现阶段微生物转化产物并不能提前预测反应结果，更难以从底物合成目标转化产物，转化后的成分鉴定和纯化工作繁杂。（4）若转化的底物有毒性，会杀死微生物导致转化无法进行。

针对以上不足，我们可以综合运用物理化学诱变技术、基因重组工程技术和原生质体融合技术选育优良菌种。同时，应增加对微生物转化菌株酶系的研究，利用多种生化手段，对转化酶系的分离、提纯、表征和功能进行研究，阐明底物在特定酶系下的转化过程和转化机制，最终实现微生物转化的机制清楚和目标可控的目标[32]。

4 展望

二十一世纪以来，微生物转化技术因其独特的优势加快了中药现代化建设的进程，但由于我国对于微生物转化技术的系统研究历程较短以及中药的成分十分复杂，导致微生物转化中药的应用还处于一个研究初级阶段，对于大规模的工业化研究生产上不适用。随着交叉学科及技术的发展，微生物转化这一新兴技术在中药新药研究开发中占有越来越重要的地位，对形成具有自主知识产权的新药具有极其广阔的前景，微生物转化技术对中药的应用也越发广泛。在接下来的研究中，要合理的联合基因、细胞、蛋白质、代谢工程和固定化酶等技术进行筛选，培育以及改建菌株来获取对我们有益的微生物，并深入探讨该微生物发生转化的机理与途径，从而进一步简化中药有效成分的分离纯化过程，高效率、高产率地获得目标产物，达到微生物转化技术大规模应用于中药工业化生产与制备的目的。综上所述，微生物转化技术为加快中药走向现代化及国际化，增强中药的国际影响力发挥了重要的作用，值得进一步探究。

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（收稿日期：2019-07-19）