ATP13A2基因Ala746Thr位点突变与帕金森病的关系

孔雪燕,周东瑞,孟新玲,李艳霞,杨新玲*

(1新疆医科大学第二附属医院神经内科,乌鲁木齐 830000;2新疆医科大学附属中医医院脑病一科;*通讯作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的进行性神经系统退变性疾病,按年龄可分为早发性帕金森病(early onset Parkinson’s disease,EOPD)(发病年龄≤50岁)和晚发性帕金森病(late onset Parkinson’s disease,LOPD)(发病年龄>50岁)。PD的主要病理改变是中脑黑质区多巴胺能神经元的变性死亡、纹状体多巴胺含量显著减少以及黑质区残存神经元胞质内出现嗜酸性包涵体(即路易小体)。其病因及发病机制至今尚未阐明,涉及年龄、遗传、环境等多个方面,关于遗传因素的探索主要来源于对表现出孟德尔遗传性疾病家庭的研究。研究发现Parkin,Pink1,DJ-1,ATP13A2,PLA2G6和FBXO7基因的常染色体隐性突变与PD易感性相关联[1-6]。其中ATP13A2基因被认为与EOPD相关。经过国内国外的多年研究积累,目前已发现ATP13A2基因的多个位点突变与帕金森病相关[7-10],其中对Ala746Thr突变位点研究较多,在新疆地区对于ATP13A2基因的研究较少,笔者欲在新疆地区研究ATP13A2基因Ala746Thr位点与帕金森病发病的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 一般资料 病例组为就诊于新疆医科大学第一附属医院、第二附属医院及附属中医医院门诊及病房的帕金森病患者224例,其中男性116例,女性108例,发病年龄为41-80岁,平均发病年龄为(63.40±10.30)岁,维吾尔族44例,汉族180例。对照组为同期与病例组性别、年龄、民族相匹配的,与病例组就诊于相同医院的健康体检者及志愿者人群220例,其中男女各110例,发病年龄为40-80岁,平均发病年龄(61.67±9.72)岁,维族53例,汉族167例。两组在性别、年龄、民族之间的比较差异均无统计学意义(P>0.05,见表1)。

1.1.2 纳入及排除标准 纳入的PD患者均为散发;其诊断符合英国Brain Bank标准[11],排除因中毒、服用抗精神病药物等继发性PD、帕金森叠加综合征和其他神经系统疾病,甲亢及严重的器质性疾病。纳入病例组的患者均由两个副主任医师级别以上的医师严格按照以上诊断标准诊断。病例组与对照组个体之间无血缘关系,均为本地居民(至少2代亲系在新疆生活)。所有受试对象入组前均得到本人同意,并签署知情同意书。

表1 病例组与对照组一般情况的比较Table 1 Comparison of the general situation between case group and control group

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取 得到受试对象同意后抽取其肘静脉血2 ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,使用天根生化(北京)有限公司基因组非离心柱型DNA提取试剂盒提取DNA,并严格按照说明书操作,-20 ℃保存。

1.2.2 引物的设计与合成 引物序列的设计是根据NCBI数据库获得ATP13A2基因序列找到位点所在位置,由上海生工公司合成。Ala746Thr位点其上游引物为F3 5′-CCACCCACTCTGAGGACTA-3′,下游引物为R3 5′-CAAGGGCCCA-AAAAGATG-CC-3′,PCR 产物长度365 bp。

1.2.3 聚合酶链反应(PCR) PCR反应体系:模板DNA 10-20 ng,10*PCR Buffer(Mg2+plus)3 μl,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3 μl,上、下游引物(5 μmol/L)各1.5 μl,TaKaRaTaq酶(5 U/μl)0.3 μl,加水至30 μl。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,69 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s。共35个循环。4 ℃保存。用美国ABI生产的Veriti 96well PCR仪进行扩增。将扩增后的PCR产物置于2%琼脂糖凝胶,核酸染料染色,凝胶成像仪(英国Syngene)确认扩增产物的质量。

1.2.4 直接测序 使用PCR产物纯化回收试剂盒进行纯化后应用美国ABI 3730Xl测序仪用双脱氧链末端终止法(Sanger法)进行ATP13A2基因Ala746Thr位点测序,判定样本的基因型,测序结果使用DNA STAR软件进行分析,GG型为纯合子(野生型),GA型为杂合突变(突变型),AA型为纯合突变(突变型)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 ATP13A2基因Ala746Thr位点PCR扩增产物

ATP13A2基因Ala746Thr位点经PCR扩增后产物片段为365 bp,2%琼脂糖凝胶电泳上可显示PCR扩增产物(见图1)。

M. DNA Marker带;1-9. Ala746Thr位点PCR扩增产物

2.2 SNP分型结果

224例PD患者样本的ATP13A2基因Ala746Thr位点检测发现1例GA型(突变型),突变病例为EOPD汉族女性患者,其余均为GG型(野生型),未发现AA基因型突变(见图2)。220例对照组样本,Ala746Thr位点检测均为GG型,未发现GA型及AA型突变。

A. GG型(野生型) B. GA型(突变型)箭头所指为碱基替换处,从左向右第13个碱基序列由G突变成了A

2.3 病例组与对照组Ala746Thr位点等位基因及基因型频率的比较

两组Ala746Thr位点等位基因及基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

2.4 按性别分层Ala746Thr位点等位基因及基因型频率的比较

男性病例组与对照组Ala746Thr位点等位基因及基因型频率比较差异无统计学意义(P>0.05);女性病例组与对照组Ala746Thr位点等位基因及基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

2.5 维吾尔族与汉族Ala746Thr位点等位基因及基因型频率的比较

维吾尔族病例组与对照组Ala746Thr位点等位基因及基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05);汉族病例组与对照组Ala746Thr位点等位基因及基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

2.6 按年龄分层Ala746Thr位点等位基因及基因型频率的比较

≤50岁病例组与对照组Ala746Thr位点等位基因及基因型频率比较差异无统计学意义(P>0.05);>50岁病例组与对照组Ala746Thr位点等位基因及基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

2.7 病例组Ala746Thr位点不同性别、年龄之间基因型及等位基因频率的比较

病例组男性与女性Ala746Thr位点等位基因及基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05);病例组≤50岁与>50岁的Ala746Thr位点等位基因及基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表3)。

3 讨论

人类ATP13A2基因位于1p36 PARK9位点内,全长26 kb,共29个外显子,开放编码区含3 543个核苷酸,共编码1 180个氨基酸[4],最初被鉴定为Kufor-Rakeb综合征(KRS)的致病基因,KRS是罕见的青少年型帕金森病的遗传形式,除了有帕金森病症状外,还存在有痉挛、痴呆、核上性注视麻痹,1994年由Najim等[12]在约旦的Kufor-Rakeb社区5名未受影响的血缘亲属中首次提出,2006年Ramirez等[4]在一个同源的智利家庭中鉴定出复合杂合子ATP13A2突变,并且这个基因突变也在约旦家族中被证实。此后在早发性、家族性或散发性PD患者中发现了一些纯合子(Phe182Leu[7],Gly504Arg[8]和Gly877Arg[9])和杂合子(Thr12Met[8],Gly533Arg[8],Ala746Thr[10])错义突变,纯合子突变通常导致青少年出现帕金森综合征(10-22岁),而杂合突变与早发性帕金森综合征有关。

Lin等[10]在182例PD患者(71例来自台湾,111例来自新加坡)和589例未患有PD的对照者(220例来自台湾,369例来自新加坡)中发现3例PD患者有ATP13A2基因Ala746Thr位点突变,包括2例散发的EOPD(1例来自台湾,1例来自新加坡)和1例家族性LOPD(来自台湾),由此得出亚洲罕见的ATP13A2变异与帕金森病患病风险增加有关。需要进一步的研究来阐明这种遗传风险因子的功能作用。Chen等[14]研究台湾493例PD患者和种族匹配的585例对照者时发现2例PD患者及4例正常对照存在ATP13A2基因Ala746Thr位点突变,且在1例对照者的99mTc-TRODAT-1 SPECT研究中显示在右侧纹状体中99mTc-TRODAT-1摄取不对称减少,与PD的征象相似,此对照者有嗅觉下降,这提示黑质纹状体多巴胺能途径有缺陷。Fei等[15]对中国大陆532例PD患者和480例健康对照研究中发现2例ATP13A2基因Ala746Thr位点突变,其中1例为EOPD,1例为健康对照者(年龄>50岁),并得出ATP13A2基因Ala746Thr变异与中国大陆汉族人群帕金森病缺乏关联。Chan等[16]在中国大陆262例PD患者和182例健康对照组中发现3例突变,其中2例为PD患者(1例为EOPD,1例为LOPD),1例健康对照者,没有发现ATP13A2基因Ala746Thr位点突变与EOPD或LOPD之间的关联。Pan等[17]用Meta分析的方法探讨汉族人群ATP13A2基因Ala746Thr位点突变与帕金森病的相关性得出该位点突变与汉族人群帕金森病患者的发病风险无关。

表2 Ala746Thr位点总体及按性别、年龄、民族进行分层后基因型及等位基因频率的比较 例(%)Table 2 Comparison of genotype and allele frequencies in overall and after stratified by sex, age and ethnic in Ala746Thr site cases(%)

表3 病例组Ala746Thr位点不同性别、年龄之间基因型及等位基因频率的比较 例(%)Table 3 Comparison of genotype and allele frequencies among different genders and ages in case group at the Ala746Thr site cases(%)

由以上可知ATP13A2基因Ala746Thr位点突变频率很低,其与PD发病风险的关系仍需进一步探讨。ATP13A2基因Ala746Thr位点突变在新疆地区研究较少,王芳等[18]对新疆地区429例PD患者和390例正常对照者研究未发现ATP13A2基因Ala746Thr位点突变,李沛珊等[19]通过研究新疆地区4个无血缘关系家系共16例家族性PD患者、220例散发性PD以及240例健康对照组也没有发现Ala746Thr位点突变,为进一步探讨ATP13A2基因Ala746Thr位点突变与PD发病的关系,本研究扩大了研究范围,涉及新疆乌鲁木齐多个三甲医院,对受试对象进行更加细致的问卷调查(包括睡眠、嗅觉、认知功能等多个方面),共纳入224例病例组与220例对照组,受试对象均来自新疆南北疆本土的维吾尔族和汉族居民,发现1例ATP13A2基因Ala746Thr位点GA基因型杂合突变,未发现AA基因型突变,经统计分析病例组与对照组基因型及等位基因分布差异无统计学意义,通过性别、年龄、民族分层比较差异仍没有统计学意义,与既往研究结果基本一致。突变样本Wp377为PD患者,女性,汉族,发病年龄为44岁,病程1年,此患者首发症状为运动迟缓,左下肢肌张力增高,左膝关节疼痛,未见明显静止性震颤,美多芭初始治疗有效,PETCT提示右侧顶叶脑FDG代谢减低,右侧壳核体尾部及左侧壳核尾部CFT呈低代谢,考虑帕金森病改变。因突变率太低,无法与其他GG型PD患者进行临床比较。

本研究在224例PD患者中仅1例ATP13A2基因Ala746Thr位点突变,提示新疆地区ATP13A2基因Ala746Thr位点突变是鲜有的,ATP13A2基因Ala746Thr位点突变可能不是新疆地区PD患者发病易感因素。结合世界各地的各项研究也提示ATP13A2基因Ala746Thr位点突变在PD患者中仍存在,我们的研究同样扩大了ATP13A2基因突变的症状谱,为进一步研究ATP13A2基因对PD的发病机制研究提供了一定的临床资料。鉴于本研究样本例数较少,且收集病例均来自新疆大型三甲医院,样本可能存在信息偏倚,日后需继续扩大样本数量以及收集范围进行研究。