IL-4及IL-6在桥本甲状腺炎中的表达及意义

马士芬,王娟红,魏 威,方航荣,段 瑛,黑利娟,徐俊荣

(1西安交通大学医学院附属西安市中心医院消化科,西安 710003;2延安大学医学院;3西安交通大学医学院附属西安市中心医院病理科;4西安市第三医院病理科;*通讯作者,E-mail:657237987@qq.com)

桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)是最常见的器官特异性自身免疫性疾病之一,女性发病率是男性的3-4倍,欧洲发病率为0.1%-5%,中国发病率为0.4%-1.5%[1]。它的主要特征是甲状腺组织内大量的淋巴细胞浸润,甲状腺肿大、纤维化,甲状腺细胞逐渐破坏,最终导致甲状腺功能减退[2]。HT的发病机制尚未完全明确,有研究发现Th1/Th2细胞免疫失衡在HT的发病过程中发挥着重要作用。但是,研究结果相互矛盾,一些研究认为HT患者血清中Th1型细胞因子亢进占优势[3],另一些研究结果提示HT患者血清内Th2型细胞因子水平显著增高。为探讨Th1/Th2细胞免疫失衡在HT发病过程中的作用,本研究拟采用多种方法对HT患者血清及病变甲状腺组织中的Th1或Th2型细胞因子进行检测、分析。

1 资料与方法

1.1 病例资料

20例HT患者血清样品均来自西安市中心医院外科及内分泌科经临床、甲状腺功能检测、手术及病理确诊病例,另外选取18例查体正常人群血清为对照。20例HT石蜡组织标本来自西安市中心医院病理科2010-01～2014-02存档蜡块;同期18例甲状腺腺瘤旁正常甲状腺石蜡组织标本作为对照组,其中,女17例,男1例,年龄25-67岁,平均年龄46.5岁。

1.2 主要试剂与实验方法

1.2.1 主要试剂 RayBiotech QAH-TH-1抗体芯片细胞因子定量检测试剂盒购自广州瑞博奥生物科技有限公司;细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6检测ELISA试剂盒购自上海森雄公司;免疫组化抗体小鼠抗人TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-4R、IL-6R单克隆抗体购自福州迈新公司;SP二抗试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。

1.2.2 抗体芯片法检测HT患者血清中细胞因子浓度 选择15例HT患者及13例正常查体人群,常规采血2 ml,室温静置1 h,3 000 r/min离心10 min,取血清1 ml,-70 ℃保存。采用RayBiotech QAH-TH-1抗体芯片细胞因子定量检测试剂盒检测血清中10种细胞因子浓度,主要包括Th1细胞因子IL-2、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α和Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13。实验完成后,将玻片框架拆掉,芯片送广州瑞博奥生物科技有限公司,采用激光扫描仪InnoScan 300 Microarray Scanner,在波长532 nm,分辨率10 μm进行扫描,采用QAH-TH-1的数据分析软件进行数据分析。

1.2.3 ELISA法检测HT患者血清中细胞因子浓度 对5例HT病例及5例正常查体人群,常规采血2 ml,室温静置1 h,3 000 r/min离心10 min,取血清1 ml,-70 ℃保存。细胞因子IL-4、IL-6、IFNγ及TNF-α均采用双抗体夹心ELISA法检测。用全自动酶标分析仪测A450 nm值,依标准品值制作标准曲线,计算细胞因子浓度(ng/L)。具体步骤按说明书严格操作。

1.2.4 免疫组化检测甲状腺组织中细胞因子及细胞因子受体蛋白表达 用免疫组织化学方法检测20例HT病变甲状腺组织及18例正常的甲状腺组织中Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ,Th2型细胞因子IL-4、IL-6的表达及其相应细胞因子受体的蛋白表达情况(用阳性例数/总例数的百分数表示)。同时,观察分泌细胞因子的细胞类型。免疫组化染色采用常规链霉菌素亲生物素-过氧化酶连接法(SP法)。TNF-α、IFN-γ单抗1 ∶50稀释,IL-4、IL-6单抗1 ∶200稀释,IL-4R、IL-6R单抗1 ∶100稀释,以胞浆呈棕黄色为阳性,阴性对照为用PBS代替一抗或用含有小鼠单抗IgG1的神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP,Dako)稀释至与一抗相同IgG1浓度代替单抗。

2 结果

2.1 抗体芯片法定量检测血清中10种Th1/Th2细胞因子表达水平

与正常对照组相比较,HT组血清中IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α浓度水平显著升高,差异具有统计学意义(均P<0.05,见表1),其余7种细胞因子差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2.2 ELISA法检测血清中Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ,Th2型细胞因子IL-4、IL-6的浓度水平

ELISA法检测5例HT患者,5例正常人血清,结果显示,与正常人血清相比较,HT患者Th2型细胞因子IL-4、IL-6浓度水平均显著升高,Th1型细胞因子TNF-α浓度水平在HT患者显著降低,差异有统计学意义(均P<0.05,见表2);IFN-γ在HT患者中无显著变化(P>0.05,见表2)。

表1 抗体芯片法检测HT患者及正常人血清中细胞因子浓度结果 (pg/ml)Table 1 Concentrations of cytokines in serum of HT patients and normal subjects by antibody chip method (pg/ml)

2.3 免疫组织化学方法检测正常对照组及HT组甲状腺组织中细胞因子及其受体表达

用免疫组织化学(IHC)方法研究HT患者病变甲状腺组织中Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ,Th2型细胞因子IL-4、IL-6的表达及其相应细胞因子受体的表达情况;同时,观察分泌细胞因子的细胞类型,结果发现,HT组甲状腺组织中IL-4、IL-6细胞因子蛋白主要表达于甲状腺病变上皮细胞内,部分表达于浸润的淋巴细胞(见图1)。HT组与对照组相比较,Th2型细胞因子IL-4、IL-6蛋白表达均显著升高,且IL-4、IL-6受体在HT中也显著升高,差异具有统计学意义(均P<0.05);Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ蛋白表达在正常与病变甲状腺组织内表达无统计学意义(均P>0.05,见表3)。

表2 ELISA法检测HT患者与正常人血清中细胞因子浓度表达水平 (pg/ml)Table 2 Expression level of cytokine in serum of HT patients and normal subjects by ELISA (pg/ml)

3 讨论

HT是常见的自身免疫性甲状腺疾病之一,它的发病机制尚未完全明确,相关研究发现细胞因子在HT的发病过程中扮演重要的角色。细胞因子是一类在体内有广泛生物学效应的多肽物质,主要包括Th1细胞分泌的IL-2、IFN-γ和TNF-α以及Th2细胞分泌的IL-4、IL-6、IL-13等细胞因子,Th1细胞因子主要介导细胞免疫,而Th2细胞因子促进抗体的产生,介导体液免疫[4]。Th1/Th2细胞因子的平衡在维持机体免疫功能的稳定中发挥重要作用,失衡则可引起免疫介导的疾病。有研究[3]发现Th1/Th2细胞免疫失衡在HT的发病过程中发挥着重要作用,表现为Th1细胞因子亢进占优势。而同为自身免疫性疾病的Graves’病却表现为Th2细胞因子亢进占优势。

A.IL-4胞浆阳性(SP法,×40);B.IL-4R胞浆阳性(SP法,×40);C.IL-6胞浆阳性(SP法,×100);D.IL-6R胞浆阳性(SP法,×40)

表3 HT与正常甲状腺组织中细胞因子及其受体免疫组化检测阳性率比较 例(%)Table 3 Comparison of positive rate of immunohistochemical detection of cytokines and their receptors between HT and normal thyroid tissue cases(%)

在本研究中,我们采用多种方法定性及定量检测HT患者血清及病变组织中细胞因子浓度及蛋白表达。抗体芯片定量检测发现,HT组IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α浓度水平显著升高;ELISA法和IHC法分别检测HT患者血清及病变组织中Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ,Th2型细胞因子IL-4、IL-6的浓度及其蛋白表达。结果发现,HT组Th2型细胞因子IL-4、IL-6在血清中浓度及组织中蛋白表达均显著升高,IL-4、IL-6受体在HT甲状腺组织中蛋白表达水平也显著增高,细胞因子蛋白及受体蛋白主要表达于甲状腺病变上皮细胞内,部分表达于浸润的淋巴细胞胞浆内,这些结果提示Th2型细胞因子IL-4、IL-6在HT的发生、发展中可能发挥重要作用。

IL-4通常由Th2细胞、肥大细胞、嗜碱细胞产生,多数研究证明IL-4水平在自身免疫性疾病中显著升高[5]。有文献报道[6]Th2细胞产生的IL-4、IL-13可增加双氧化酶2及其表达水平,使细胞外产生大量H2O2进而通过氧化应激损伤甲状腺细胞。覃伟武等[7]发现HT患者血清中TNF-α、IL-4含量均显著高于正常对照组,提示Th1和Th2两型细胞因子水平均增高。Santaguida等[8]研究发现IL-4+淋巴细胞增加与自身免疫性甲状腺疾病和非内分泌自身免疫性疾病有关。以上研究均表明IL-4在自身免疫性甲状腺疾病中扮演着重要的角色。

IL-6作为一种多效性细胞因子,参与机体的多种病理和生理过程。有证据表明,在肥胖及自身免疫性疾病中IL-6水平明显升高,如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、过敏性荨麻疹、克罗恩病等疾病中;在自身免疫性甲状腺疾病中,如Graves’病、亚急性甲状腺炎、胺碘酮诱发的甲状腺毒症中也显著升高[9]。关于IL-6与HT之间关系的研究尚少,Ruggeri等[10]研究发现HT患者IL-6水平是增高的;Siemińska等[9]也发现与对照组相比,HT的女性血清中IL-6水平有所增加,这表明IL-6与疾病的发展有关。IL-6可以调节甲状腺细胞的生长与分化,在甲状腺疾病中表达增强,从而诱导单核细胞趋化因子蛋白1(MCP-1)在滤泡细胞中产生,并增强淋巴细胞浸润,其在甲状腺细胞中的表达与淋巴细胞浸润程度呈正相关[11,12]。本研究在HT患者血清中发现IL-6水平明显升高,甲状腺病变组织中蛋白表达增高,提示IL-6可能与HT发病相关。

IL-4、IL-6作为Th2型细胞因子,可诱导B淋巴细胞增殖、分化和成熟,促使其产生IgE和IgG等抗体,抑制Th1型自身反应性T细胞分化激活而介导的免疫反应[4]。从而使Th1/Th2细胞因子的平衡向Th2型细胞因子偏移,表现为Th2细胞因子亢进占优势。多数研究发现HT患者的Th1/Th2细胞平衡向Th1方向偏离,我们的研究通过三种不同的方法,在HT患者血清及组织中均发现IL-4、IL-6水平增高,蛋白表达也显著增高,提示HT中细胞因子失衡向Th2方向偏离。

我们考虑这一结果可能与研究对象的疾病进展时期不同有关,以往的文献[4,7,9]中研究的HT患者几乎均处于临床早期诊断阶段,并基于血清学研究结果。我们的研究中,HT患者均为已经形成甲状腺结节,处于临床HT较晚期,临床已经无法鉴别疾病良、恶性而行手术切除患者。据文献报道[13,14],形成甲状腺结节的HT患者中,甲状腺乳头状癌发病率显著升高,黏膜相关B细胞淋巴瘤的发病率也显著升高。在临床病理诊断过程中,手术切除的HT患者甲状腺结节组织需要仔细取材,寻找是否有上皮癌变成分。我们的研究结果还发现IL-4、IL-6及其受体均存在于HT病变甲状腺上皮细胞及浸润的淋巴细胞内,这一发现也符合桥本甲状腺炎上皮细胞嗜酸性化生、异型增生、癌变这一临床病理过程及黏膜相关淋巴瘤源于HT组织中浸润的淋巴细胞这一理论。因此,HT患者中,TH2型细胞因子IL-4、IL-6增高可能与HT恶变(甲状腺乳头状癌及黏膜相关B细胞淋巴瘤)相关。

HT的发生机制错综复杂,与环境、基因、细胞因子失衡等多方面相关。大量文献表明HT与甲状腺乳头状癌发生相关。我们的研究结果发现IL-4、IL-6在HT患者血清中水平增高,病变组织中表达增高,且IL-4、IL-6受体在HT患者甲状腺组织中也高表达,提示IL-4、IL-6可能在HT的发生、发展、恶变过程中可能发挥了一定的作用。我们的研究结果为通过检测血清学细胞因子监测HT早期恶变提供了新的研究思路。