百草枯中毒后外周血CD4+T细胞PD-1/PD-L1信号通路的表达

付国强,王伯良,魏 妮,黄 潭,周 丹

(空军军医大学第二附属医院急诊科,西安 710038)

百草枯(paraquat,PQ)是一种兼有内吸作用的接触灭生性除草剂,口服中毒对人体会产生致命性损伤。PQ中毒机制复杂,公认的观点为氧化应激、炎症反应及细胞因子激活等[1]。临床研究表明:具有免疫抑制作用的激素联合环磷酰胺早期应用,能够降低炎性介质释放,降低多器官功能衰竭发生率[2]。因此,了解PQ中毒后免疫系统的变化显得十分重要。

T细胞免疫在炎症性疾病发生发展中起关键作用,其活化需要双重刺激信号,其中第二类共刺激信号能减弱、限制和(或)终止T细胞免疫应答,抑制炎症反应,程序性死亡因子(programmed death,PD)1及其配体(PD-L)信号通路是其中重要成员[3]。免疫激活所导致的炎症反应是百草枯中毒发病机制之一,作为影响T细胞免疫的重要因素,PD-1及其配体在百草枯中毒后会产生怎样的变化,这些变化会对病情产生怎样的影响?目前尚缺乏相关研究。本实验以PQ中毒患者为研究对象,检测中毒后24 h,72 h,120 h外周血CD4+T细胞PD-1和PD-L1阳性率及PD-1和PD-L1在外周血单个核细胞中的蛋白表达,同时观察血清IL-10及TNF-ɑ表达水平,探讨CD4+T细胞PD-1/PD-L1信号通路和中毒后免疫变化之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

PQ中毒患者30例(均为口服中毒)作为中毒组,剔除中毒前肺炎、扁桃体炎、上呼吸道感染等感染性疾病患者,男12例,女18例,年龄15-68岁,平均(31.67±6.72)岁。口服20%百草枯溶液10-30 ml,平均(19.17±2.25)ml。观察点为中毒后24 h,72 h,120 h。所有PQ中毒患者采用相同的救治方法:清除毒物(洗胃、蒙脱石散吸附、甘露醇导泻、血液净化);抗氧化剂治疗(大剂量维生素E及大剂量维生素C,还原性谷胱甘肽);保护重要脏器等常规治疗;且均未应用激素及免疫抑制剂。选取同时期本院健康体检者30例为对照组,其中男16例,女14例;年龄17-65岁,平均年龄(32.45±7.36)岁。纳入与排除标准:各项常规体检项目正常,排除自身免疫性疾病、感染和肿瘤等存在免疫炎症的患者。两组性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

表1 中毒组和对照组年龄、性别比较Table 1 Comparison of gender and age between poisoning group and control group

1.2 主要试剂和仪器

Anti-humanCD4-PerCP、anti-humanCD279(PD-1)APC、anti-humanCD274(PD-L1)-PE荧光素标记单克隆抗体及其Mouse IgG1同型对照抗体、红细胞裂解液、去离子水均购自Biolegend公司;流式细胞检测仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.3 外周血CD4+T淋巴细胞PD-1及PD-L1表达检测

晨起取空腹外周静脉血3 ml,肝素抗凝。全血100 μl分别加入小鼠抗人CD4-PerCP、抗PD-1-APC和抗PD-L1-PE单克隆抗体5 μl,4 ℃避光环境下孵育20 min,加入10倍稀释后的红细胞裂解液2 ml,室温避光静置15 min。待红细胞完全溶血后,离心后加入PBS缓冲液,重复洗涤3次。再加入PBS300 μl,立刻上流式细胞仪检测,应用BD CellQuest软件对数据进行分析。

1.4 血清TNF-ɑ及IL-10检测

晨起取血6 ml,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝、静置30 min后,4 ℃ 3 000 r/min离心10 min,分离血浆及血清,-70 ℃保存。采用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测血清中TNF-ɑ和IL-10的表达水平。操作方法严格按照说明书进行。

1.5 蛋白免疫印迹(Western blot)检测外周血单个核细胞PD-1及PD-L1蛋白表达

应用淋巴细胞分离液分离新鲜抗凝血中的PMBC,分离出的细胞PBS清洗2次,加入RIPA细胞裂解液冰上裂解30 min,4 ℃ 14 000 r/min离心15 min,收集上清液并采用BCA法测定蛋白浓度,然后将适量细胞总蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳进行分离,并将蛋白转移至PVDF膜上,电转后的膜在含5%BSA的封闭液中室温封闭1 h。使用PD-1、PD-L1一抗4 ℃孵育过夜,PBS清洗3次,然后使用HRP标记的二抗稀释液室温孵育1.5 h,PBS洗3次。经凝胶分析系统曝光,将胶片进行扫描存档,Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 外周血CD4+T细胞PD-1及PD-L1表达水平比较

中毒后各观察点CD4+T细胞PD-1分子阳性率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),组间比较显示中毒后24 h、72 h较对照组均显著升高(P<0.01),120 h恢复正常(P>0.05,见图1,表2)。中毒后各观察点CD4+T细胞PD-L1分子阳性率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),组间比较显示:中毒后24 h、72 h、120 h较对照组PD-L1分子阳性率均显著升高,PQ中毒后24 h CD4+T细胞PD-L1分子表达明显升高,且持续到中毒后120 h(P<0.05,见图2,表2)。实验结果提示中毒后CD4+T细胞PD-1/PD-L1信号通路处于明显激活状态。

图1 中毒组与对照组外周血CD4+T细胞PD-1表达流式散点图比较Figure 1 Comparison of PD-1expression in CD4+T lymphocyte between poisoning group and control group

图2 中毒组与对照组外周血CD4+T细胞PD-L1表达流式散点图比较Figure 2 Comparison of the PD-L1expression in CD4+T lymphocyte between poisoning group and control group

表2 中毒组与对照组外周血CD4+T细胞PD-1和PD-L1表达水平比较 (%,Table 2 Comparison of PD-1 and PD-L1 expression in CD4+T lymphocyte between poisoning group and control group (%,

2.2 TNF-ɑ及IL-10检测结果比较

中毒组和对照组血清TNF-ɑ及IL-10浓度比较差异具有统计学意义(P<0.01)。组间比较:中毒24 h与对照组比较,血清TNF-ɑ及IL-10浓度明显升高(P<0.05),72 h与对照组比较仍维持在较高水平(P<0.05),120 h与对照组比较,血清TNF-ɑ及IL-10浓度无明显差异(P>0.05,见表3)。

表3 中毒组与对照组血清TNF-ɑ和IL-10比较 (pg/L)Table 3 Comparison of serum TNF-ɑ and IL-10 levels among four groups (pg/L)

2.3 外周血单个核细胞PD-1及PD-L1蛋白表达

蛋白免疫印迹结果显示:中毒后各24 h,72 h,120 h外周血单个核细胞PD-1及PD-L1目标条带灰度与对照组比较明显增高(见图3A),通过将目标条带灰度和内参条带灰度比值进行比较,中毒后24 h,72 h,120 h外周血单个核细胞PD-1蛋白表达在中毒后表达明显升高(P<0.05,见图3B),PD-L1表达也呈现相同的趋势(P<0.05,见图3C)。

A.Western blot结果 B.PD-1相对表达量比较 C.PD-L1相对表达量比较

3 讨论

百草枯口服吸收后广泛分布并损害体内多种器官[4]。PQ进入器官后,机体针对毒物会产生免疫反应[5],免疫反应被认为在PQ中毒发展过程中发挥了重要作用[6]。

T细胞免疫是细胞免疫的重要组成部分,免疫激活后,T细胞通过识别、增殖与活化对病原体进行杀伤与吞噬,同时介导细胞因子释放调理免疫[7]。PQ中毒急性期,机体即释放由CD4+T细胞所分泌的肿瘤坏死因子α等炎性细胞因子[8]。它们不仅能促使炎性细胞浸润、分化和成熟,还能导致细胞因子和炎性介质的进一步分泌和表达,从而形成庞大的细胞因子网络,影响宿主的免疫能力,最终导致机体出现全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭[9]。

PD-1/PD-L1是T细胞活化的关键负性共刺激分子,能够引起T细胞停滞于G0/G1期,显著抑制T细胞的生物学功能,调节免疫炎症反应程度[10]。PD-1表达广泛,在外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞等细胞表面活化后广泛诱导表达[3]。PD-L1是PD-1的主要配体,主要在CD4+和CD8+T淋巴细胞、抗原提呈细胞如树突状细胞和巨噬细胞上表达,PD-1通过与其配体结合抑制T淋巴细胞的功能,从而抑制自身免疫应答[11]。研究证实PD-1及其配体信号通路通过干扰CD28介导PI3K的激活抑制Akt磷酸化,发挥抑制T细胞存活及增殖、减少细胞因子合成的作用[12]。本实验中检测的TNF-ɑ和IL-10是CD4+T淋巴细胞的重要下游分子,百草枯中毒后明显升高[13],其中TNF-α是中毒导致急性炎症反应的始动因子,与患者病情严重程度及预后有一定相关性[14]。

本研究发现百草枯中毒患者外周血CD4+T细胞PD-1、PD-L1阳性率较对照明显升高,且持续升高到中毒后72 h;蛋白免疫印迹实验显示:外周血单个核细胞PD-1、PD-L1蛋白表达在各观察点较对照组明显升高。而血清炎性细胞因子TNF-ɑ和IL-10在中毒后24 h达到高峰,此后逐渐下降,中毒后120 h时与对照组比较差异无统计学意义。结果提示,PQ进入人体后会激活T细胞免疫,分泌炎性细胞因子。同时CD4+T淋巴细胞表面PD-1、PD-L1阳性率明显上升,PD-1/PD-L1信号通路激活,抑制T细胞分泌细胞因子,导致血清TNF-ɑ和IL-10浓度降低。本研究纳入患者口服中毒量较小,预后较好。我们认为PD-1/PD-L1信号通路在中毒后激活,在少量百草枯中毒患者病情好转中发挥了一定的自我保护作用。随着患者中毒量的增大,PD-1/PD-L1信号通路虽不足以整体抑制T细胞免疫激活,无法阻止病情恶化,但作为自身免疫和感染性疾病慢性化的重要影响因素[15],其高表达可能导致T细胞处于持续功能抑制,影响机体免疫状态,与中毒后继发感染、疾病的迁延不愈有一定的关系,其作用机制值得在临床治疗中予以关注。