浅谈异分化在放射诱导肺纤维化中的作用*

[河南省人民医院（河南大学人民医院） 肿瘤内科，河南 郑州 450003]

放射性肺纤维化成为胸部放射治疗后的严重并发症，因其机制不明，无早期诊断指南，也无有效标准的治疗方法，最终导致呼吸衰竭。基于国内外对放射性肺纤维化机制的多种假说，本课题组提出Ⅱ型肺泡干细胞在放射诱导下异分化为肌成纤维细胞，通过复制放射性肺纤维化小鼠模型，运用形态学和分子学方法进行验证，以期进一步明确肺纤维化的可能机制，为纤维化的诊疗奠定基础。

1 放射治疗的机制

放射治疗是指用离子射线治疗恶性肿瘤（有时也可治疗良性病变）的临床策略，其射线种类有α射线（氦原子核）、β（电子）、X/γ射线（光子）及质子。目前，用于肿瘤治疗的离子射线主要是X射线或γ射线。质子治疗仪因价格昂贵和治疗费用高而较少在临床使用。这些射线可将能量直接作用于生物大分子上，引起生物大分子电离和激发；也可先作用于水，使水分子产生一系列辐射分解产物（OH、H、e-、H2及H2O2等氧化物），再作用于生物大分子，这些都能导致机体的核酸、蛋白质及酶类分子结构改变和活性丧失，从而导致肿瘤细胞死亡，起到治疗作用[1]。但射线同时也会对正常组织造成损伤，在肺组织中，不同类型细胞对射线的敏感性存在差异，以肺上皮细胞最为敏感。

2 肺上皮细胞修复

肺组织可分为实质和间质两部分：实质即肺内支气管各级分支及其终末的大量肺泡；间质包括肺内结缔组织及其中的血管、淋巴管及神经。肺泡是支气管树的终末部分，肺泡璧由单层肺泡上皮组成，肺泡上皮主要为I型和Ⅱ型上皮细胞。I型细胞负责气体交换及调节肺泡中液体稳态，占肺泡表面积的95%；另外5%则是Ⅱ型肺泡细胞，其作用是通过分泌表面活性物质来维持稳定肺泡大小与结构。因肺与外界相通，极易受到外部有害物质的损伤，如氧化应激和毒性损伤。而I型细胞是终末细胞，不具有分裂增殖能力，其损伤丢失可依赖Ⅱ型上皮细胞的分化、分裂获得修复补充[2]。因此，肺Ⅱ型细胞被公认为肺上皮成体干细胞（adult stem cells,ASC）[3]。此外，肺细支气管上皮层内也含有可分裂、分化为细支气管上皮的成体干细胞，即Clare细胞。

3 ASC 及其微环境

干细胞的微环境对保留干细胞未分化状态具有重要意义。THOMSON等[4]于1998年从囊胚阶段的小鼠胚胎中分离出胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC），在组织培养中无限增殖并不丧失多能性的潜能。然而在体外组织培养时，ESC释放潘多拉盒子的分化程序，形成丑陋的多细胞肿块，称为畸胎瘤。与此相反，MARTIN[5]在70年代将ESC注射到小鼠胚泡中心，类似于天然生态位，ESC恢复正常使命，并有利于ESC产生正常的组织后代。因此，干细胞内在分化表型特征由其微环境决定。成体干细胞也同样依赖其微环境，卵巢生殖干细胞微环境是一种稳定结构，能诱导成体干细胞分化为卵泡细胞，使相对早期阶段的异位卵泡祖细胞去分化[6]。最近的研究表明，这些微环境提供其扩散、分化或保持休眠的信号[7]。细胞的相互作用是通过粘附或间隙连接调节ASC保留和分布[8]；细胞外基质（extracellular matrixc,ECM）组成三维细胞外网络，通过形成保护和营养生物物理过滤器，作为促进免疫反应、血管生成和组织再生的媒介[9]；可溶性蛋白因子通过改变其局部有效浓度、生物利用度和稳定性，从而调节对靶细胞的作用，如成纤维细胞生长因子-2、Wnt3、Notch及转化生长因子 -β（transforming growth factor-β,TGF-β）等[10-11]。

4 TGF-β 与肺纤维化

TGF-β是一种多效能因子，1985年首次被ASSOIAN等[12]从人血小板中分离出来，到目前已发现TGF-β的6个亚型，而哺乳动物中仅发现TGF-β1、TGF-β2及 TGF-β3。KHALIL等[13]1991年 发 现，TGF-β在肺纤维化发生过程中起重要作用。其中，TGF-β1作用更加显著。现有大量基础实验和临床研究表明，TGF-β1是重要的致纤维化细胞因子之一，发现该因子在肺纤维化组织中高表达[14]。DAS等[15]通过在体和离体实验发现，无论在人细胞株还是小鼠中，TGF-β1都有很强的促纤维化作用。P17是一种TGF-β抑制剂，在IMR-90人胚肺成纤维细胞和小鼠肺纤维化模型中能抑制TGF-β介导的肺纤维化[16]。此外，通过对人类特发性肺纤维化的研究发现，抗纤维化药物干扰素-γ（interferon-gamma IFN-γ）能降低肺组织中TGF-β水平[17]。有关TGF-β诱导肺纤维化的机制复杂，但PANDIT等[18]研究结果显示，TGF-β 可下调 Let-7 miRNA。而 Let-7 miRNA 的下调可诱导小鼠肺Ⅱ型上皮干细胞表达间质细胞标志物，肺泡间隔增厚，胶原合成增加，纤维化发生[18]，提示TGF-β导致肺纤维化的机制可能是通过下调Let-7 miRNA实现。

5 Let-7 miRNA 与肺纤维化

MicroRNA（miRNA）是长约 22 nt非编码 RNA，广泛存在于从病毒到人类的各种生物中。这些miRNA可通过3’非翻译区的互补位点与靶mRNA结合，通过mRNA降解抑制靶蛋白产生[19]。因此，miRNA是基因表达的关键调控因子[19]，如miRNA-126通过调节Toll样受体2/4信号通路中的TOMI，参与囊性纤维化[20]。miRNA-192以Smad3依赖的方式介导肾纤维化[21]。用博来霉素诱导的纤维化组织中有161种miRNA表达差异[22]。直接照射或暴露于氧化应激的药物时，miRNA微阵列分析表明组织中许多miRNA被上调或下调，特别是Let-7家族的miRNA可能对氧化应激的反应更为显著[23]。在40个特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）组织和20个对照肺组织微阵列上进行原位杂交，显示IPF中Let-7 miRNA降低[24]。提示Let-7 miRNA为正常干细胞所必需，因为上调Let-7 miRNA可完全恢复干细胞正常表型[25]。进一步研究发现let-7 miRNA是Wnt/β-catenin信号转导途径的靶分子，其表达受Wnt/β-catenin的抑制[25]。

6 Wnt/β-catenin 途径与肺纤维化

Wnt信号传导途径可分为决定细胞命运的经典途径、控制细胞运动及组织极性的非经典途径。Wnt/β-catenin途径是通过β-catenin的核内移位，从而激活靶基因的转录活性。Wnt/β-catenin途径启动信号级联反应，在脑、肠、皮肤及肺等正常组织的发育起着关键性的作用[26]。Wnt途径在乳腺癌中可增强乳腺癌干细胞的扩增[25]。IPF组织中微阵列分析显示与Wnt/β-catenin通路有关基因被上调[27]。同时对IPF患者肺Ⅱ型细胞更详细地分析发现，Wnt信号通路中相关的靶蛋白都有增加[28]。期间涉及的潜在分子途径尚未完全确定，但通过使用mRNA微阵列筛选测定法，已鉴定Let-7 miRNA作为Wnt-β-连环蛋白途径的下游靶标[25]。该过程通过激活Lin28蛋白，使Let-7 precursor miRNA 转化为 Let-7 mature miRNA 的过程受抑制实现[25]。因而笔者提出，在肺纤维化发生时，可能存在 TGF-β-Wnt/β-catenin-Lin28-let-7 miRNA调控轴。

7 肌成纤维细胞与肺纤维化

IPF患者中，ECM含量是正常肺组织的2～3倍，其主要由胶原纤维（Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ及Ⅶ）、纤连蛋白、弹性蛋白及蛋白多糖组成，大量肺纤维化研究证实，肌成纤维细胞是胶原和ECM的最主要来源[29]。正常的伤口愈合后期，成纤维细胞和肌成纤维细胞通过凋亡来减少。但在IPF患者中特别是纤维化病灶中，成纤维细胞和肌成纤维细胞数量保持不变[30]。有研究表明，在IPF组织中成纤维细胞或肌成纤维细胞数量越多，预后越差[31]。近年来许多学者认为肌成纤维细胞有3种来源[32]：①器官自身:基质成纤维细胞；②骨髓“纤维细胞”；③上皮间质转化。以上3种假设未被证实，然而目前不同原因导致的纤维化肌成纤维细胞确切来源还不清楚。

综上所述，肺组织上皮在胸部放疗过程中会造成一定的损伤，正常情况下通过Ⅱ型肺泡上皮干细胞的增殖、分化进行修复。肺纤维化患者中，上皮细胞没有得到补充修复，而为胶原和ECM所取代。纤维化组织中 TGF-β、Let-7 miRNA、Wnt/β-catenin途径中相关的靶蛋白、肌成纤维细胞都有改变。同时已证实 TGF-β 可下调 Let-7 miRNA，而 Let-7 miRNA又受到Wnt/β-catenin途径抑制（该过程通过激活Lin28蛋白实现）。笔者可假设放射导致TGF-β升高，通过Wnt/β-catenin途径激活Lin28蛋白，抑制成熟Let-7 miRNA形成，使肺泡Ⅱ型干细胞在缺乏Let-7miRNA的情况下没有正常分化，而异分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞又进一步产生ECM，从而导致肺纤维化的发生。然而假设需要被证实，希望笔者接下来的课题能确认TGF-β、Wnt/β-catenin及Let-7 miRNA相关性，同时阐明肺纤维化发生的确切机制。