MicroRNA在治疗禽类病毒性感染中的应用

高永伟，丛晓楠，孙学军，宋 琳，王 珊，洪 炀

（威海市环翠区动物疫病预防控制中心，威海 264200；2.威海市环翠区畜牧业发展中心，威海264200；3.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241 ）

我国家禽养殖量在世界排名十分靠前，但是近年来多发的禽类疾病已带来巨大的经济损失。禽类传染性疾病占禽类疾病的75%，其他病毒性疾病，例如马立克氏病、禽流感、传染性法氏囊病、禽白血病、新城疫等，也具有严重危害性。

microRNA（miRNA）作为一类短小RNA，能够在调控动物机体免疫反应和抗病毒的过程中起关键作用，在动物胚胎、肌肉和生殖等的早期发育，细胞增殖、分化、凋亡以及免疫系统应答等一系列过程中的作用已被广泛证实，新的研究热点转变为从miRNA调控机制入手探究病毒的致病机理。鸡马立克氏病毒等疱疹病毒已成为研究miRNA参与病毒疾病作用的重要模型[1]，禽类病毒与miRNA相互调控的作用机制也同样受到关注[2]。本文对近年来主要禽源病毒和miRNA相互作用的研究进展进行了综述，希望为后续的深入研究提供参考。

1 miRNA简介

miRNA是一类内源性非编码单链小RNA，长约21个核苷酸并高度保守。1993年lee等首次发现秀丽新小杆线虫（C. elegants）中的lin-4基因能够编码一组小RNA，其作用是抑制靶mRNA的翻译过程，通过与其非翻译区（3'UTR）互补配对实现[3]。将这一类非编码的小RNA命名为miRNA。成熟的miRNA 通常都具有相似特征：在真核细胞生物中广泛存在，且不具有蛋白质的编码功能；5'端含有 1 个磷酸基团，而 3'端为羟基，这是其最显著的标志，也是其他长度相同的功能 RNA 降解片段与miRNA的关键区分点；可与其上游或下游的序列通过不完全配对形成茎环结构。

成熟的miRNA与相应序列按照互补配对原则结合成双螺旋结构，随后双螺旋解旋成两条单链，其中一条与RNA诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，形成能够与目标mRNA特异性结合的非对称RISC复合物，通过引起靶mRNA的降解而实现调控。通常来说，成熟的miRNA发挥调控作用，主要是依靠与靶mRNA 3'端非编码区的部分碱基以完全或不完全互补配对的方式实现。miRNA依靠两种不同的机制：靶基因表达的下调通过mRNA的剪切和翻译抑制指导RISC 复合物而实现。目前普遍支持，miRNA沉默靶基因的机制取决于二者序列的互补程度。若靶mRNA与miRNA形成的碱基配对不严格，则mRNA的翻译受到抑制，且不诱导mRNA的降解；若形成完全互补的碱基配对，miRNA则不再抑制翻译，而是通过进入RNAi途径来调控靶mRNA的降解。多数植物miRNA与靶基因的结合是几乎完全互补的，互补结合位点不仅仅存在于3'非翻译区，而是遍布整个mRNA。对动物而言，更常见的是miRNA引导的mRNA翻译抑制，反映出动物体内的miRNA与靶mRNA序列的互补程度多为不完全互补。一般认为在病毒感染细胞的过程中，宿主细胞编码miRNA与病毒的靶mRNA结合，灭活RNA病毒，发挥潜在的抗病毒作用。Ahanda等[4]发现病毒感染后某些miRNA表达的变化，与编码蛋白mRNA的表达特征相一致，暗示miRNA可能通过免疫功能发挥其抗病毒作用。病毒寄生的生活方式，虽影响了其能力的进化，但也使其具有调控宿主细胞环境的作用。病毒可以调控自身和宿主基因表达来优化感染，其中包括编码miRNA攻击宿主细胞等方式。比如，在感染和复制的过程中，禽类疱疹病毒调控自身的miRNA表达，禽白血病病毒则改变宿主细胞的miRNA，以直接或间接的方式参与病毒的复制、增殖、感染与潜伏[5]。由此可见，鸡miRNA在调控宿主和病毒间的相互作用中起着直接或间接的作用。

2 主要禽类病毒病的miRNA研究

2.1 马立克氏病马立克氏病（Marek’s disease，MD）是一种由于感染疱疹病毒引起的，具有高度接触传染性的鸡肿瘤性疾病。马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）具有外周神经嗜性，MD的主要病理变化为淋巴组织增生和肿瘤形成。

MDV属于疱疹病毒科、马立克病毒属，该属包括有致瘤性的强毒分离株及其致弱毒株，MDV-1（Gallid Hepersvirus-2）；无致病性的毒株，MDV-2（Gallid Hepersvirus-3）；火鸡疱疹病毒，MDV-3（MeHV-1）。其中只有 MDV-1 感染鸡，其他两种均不致病[6]。

截至目前，miRBase数据库已记录的病毒miRNAs有406个，其中疱疹病毒编码的miRNAs392个，共有90个miRNAs由3种MDV编码。2006年首次在MDV-1强毒株RB1B感染的鸡胚成纤维（chicken embryo fibroldast，CEF）细胞中发现MDV编码的miRNAs[7]，目前MDV-1编码的pre-miRNAs已经鉴定出14个，形成3个明显的miRNA簇。一个位于原癌基因meq附近，一个存在于潜伏相关转录物本（latency associated transcript，LAT）内部，最后一个由mdv1-miR-M1、mdv1-miR-M11和mdv1-miR-M32构成基因簇，位于前两个基因簇之间。在MDV-1与MDV-2共感染的MSB-1细胞中共鉴定出17个pre-miRNAs[8]。后期又发现mdv2-miR-M32，现共鉴定出18个pre-miRNAs，但是MDV-2编码的miRNAs功能尚不清楚。

MDV-1编码miRNAs中以MDV-miR-M4的报道较多，该分子位于 Meq基因簇，并同源于宿主原癌基因miR-155[10]。在基因和蛋白水平均已被证实，MDV-miR-M4是MD肿瘤中表达水平最高的病毒miRNA[7]。如果RB1B毒株的MDV1-miR-M4突变，该毒株则不能将感染的T细胞转化[11]，由此证明MDV的致瘤性与MDV1-miR-M4密切相关。另外，MDV1-miR-M4 可靶向与病毒形成有关的基因UL28 及 UL32，并参与调节淋巴细胞增殖、分化和特异性转录。

MDV1感染过程中高表达的MDV1-miR-M4-5p，是一种miR-155功能同源物。miR-155是一类已知的原癌基因，在肾癌[12]、白血病[13]、淋巴癌[14]等恶性肿瘤致癌过程中发挥着重要作用。因此人们认为MDV1-miR-M4-5p在MDV的致瘤过程中也应该发挥着非常重要的作用。早期研究发现MDV1-miR-M4-5p在病毒感染后18 d即可被检测到，并且贯穿整个感染过程[15]。研究发现单个MDV1-miR-M4 分子和超强（very virulent，vv）毒株GX0101 的整个Meq基因簇被敲除后，突变毒株的致瘤率从100%分别降低到18%和 4%[16]。

研究表明MDV编码的miRNAs与病毒的潜伏、复制及肿瘤的发生发展密切相关，而MDV感染所引起的肿瘤也可用疫苗加以预防，因此MDV可以作为在肿瘤调控、遗传学及免疫学等领域研究miRNA功能的良好模型。

2.2 传染性法氏囊病传染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD）作为一种攻击雏鸡免疫系统的重要疾病，由传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起，以损害法氏囊中的淋巴细胞，引起免疫抑制和增加对其他病原体的易感性为特征，被称为“世界三大禽病”之一。IBDV属于双RNA病毒科、禽双RNA病毒属，包括血清Ⅰ型和Ⅱ型[17]。IBDV的整个基因组由A和B两个部分组成，共表达5种聚蛋白，依次命名为VP1～5。其中VP2～5由A编码，VP1则由B编码。VP1具有多聚酶和加帽酶活性。VP2则是病毒的主要结构蛋白，其中还包含IBDV 的主要抗原决定簇，可诱导机体产生中和抗体。近年来鸭传染性法氏囊病作为一种鸭的急性传染病开始发生和流行[18]，而鸡传染性法氏囊病依旧广泛发生和流行，因此出现IBDV不断扩散而导致的鸡鸭之间的相互感染。同时研究发现与IBD疫场密切接触的麻雀、鸽子、云雀等也存在着IBDV感染[19]。王永山等[20]报道鸭、鹅、麻雀等禽类血清IBDV阳性率分别为95.5%、9.4%、24%，说明上述几种禽类已经成为IBDV携带者或传染源，其中鸭最易感染。

禽类感染IBDV后，会出现急慢性炎性损伤、免疫抑制和细胞凋亡。感染1～3 d后，淋巴细胞发生凋亡、变性、裂解和坏死，细胞因子在感染的法氏囊中大量释放，巨噬细胞增加。B淋巴细胞的急剧减少伴随着剧烈的炎症反应，继发免疫抑制，使机体对其他病原体的易感性增强。此外，IBDV还可以诱导多种细胞的凋亡和内源性生化反应，例如非洲绿猴肾（Vero）细胞、外周血淋巴（peripheral blood lymphocyte，PBL）、法氏囊淋巴细胞、鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast，CEF）等[20]。

目前通过诱导表达差异的细胞内源性miRNA来调控IBDV编码的研究报道虽少，但人们已经利用miRNA干扰病毒复制、激发干扰素介导的抗病毒活性，以及探索影响侵染病毒基因的表达的原理和基因重组技术来对抗IBDV感染[21]。

肖琛闻等[22]、全荣等[23]研究发现，IBDV感染的CEF细胞、B细胞中有多个内源性miRNA表达发生显著变化，且靶基因主要富集在细胞生物学过程、代谢调节以及MAPK、Wnt等信号通路上，提示IBDV感染引起的宿主miRNAs表达情况改变，可能通过多条途径参与病毒致病以及抗病毒过程实现。欧阳伟等[24]研究发现重组慢病毒pri-gga-miRNA-21感染鸡DF-1细胞，抑制IBDV复制的功能，是通过显著抑制VP1基因翻译实现的。鸡热休克蛋白90（chicken heat-shock protein 90，cHsp90）是IBDV的一个功能型组分，用以感染细胞受体[25]，因而具有-cHsp90α抗性的miRNA能够靶向宿主细胞内源蛋白基因，进而抑制IBDV致病性[26]，拥有显著的抗病毒效果。

由此可见，利用miRNA靶向宿主细胞，或依靠基因重组技术调控IBDV相关基因，能够有效抑制IBDV的致病能力，为 IBDV的防治提供了研究思路与方向。

2.3 禽白血病禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）属于反转录病毒科、α-反转录病毒属，根据囊膜蛋白的差异将其分为A、B、C、D、E、J六个亚群。其中，A、B、J亚群是在鸡群中引发肿瘤的主要外源性ALV。E亚群病毒普遍存在于鸡群中，是无致瘤性的内源性ALV，对鸡群影响小。研究显示，鸡是ALV的自然宿主，目前还没有禽白血病出现在鸭群中的报道。但ALV的核酸也广泛出现在鸭群中，并呈现出与鸡具有不同分子生态的白血病病毒核酸，多为内源性E亚群，但鸭群中是否存在外源性白血病病毒仍然需要进一步研究[27]。J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒（sub-group J Avian leukosis virus，ALV-J）引起的肿瘤性疾病，ALV-J属于禽肉瘤病毒群（Avian sarcoma viruses，ASVs）、反转录病毒科（Retroviridae）、甲型反转录病毒属（Alpharetrovirus）[28]。ALV-J感染是我国禽业生产中流行和爆发的常见疫病之一。骨髓细胞性白血病（myeloid leukosis，ML）或称骨髓细胞瘤病（myeloey tomatosis）也由ALV-J引起。自2009年初以来，湖北、山东等省疑似病例频发，鸡群ALV感染率高达60%，死亡率高达50%以上，但尚未研制出防治效果好的疫苗。

生物信息学分析显示，存在可以靶向5'UTR的4个候选miRNAs分子，在特异miRNA抑制子分别抑制候选miRNAs分子时，发现psi-5'UTR被抑制的活性可以在抑制gga-miR-1650时被显著还原（P=0.0014），但gga-miR-1650的过表达则使psi-5'UTR的活性受到显著抑制。研究发现，在ggamiR-1650与5'UTR的结合过程中发挥作用的包括gga-miR-1650的种子区和非种子区，gga-miR-1650的过表达抑制了含有其靶点的ALV-J的复制。进一步分析发现ALV-J毒株中保守存在gga-miR-1650的靶点序列，验证了ALV-J各流行毒株的复制可被gga-miR-1650抑制，研究结果为ALV-J的防控和净化提供了基础[29]。

ALV-J感染诱导宿主细胞内源miRNA表达变化已经成为ALV-J致瘤机制研究新思路。研究发现ALV-J感染鸡的肝脏肿瘤细胞中，4个miRNA表达发生了显著改变，生物信息学分析表明肿瘤形成的信号通路，如MAPK和Wnt信号通路，可能是这些差异表达 miRNA参与的结果。研究人员在ALV-J感染的10周龄鸡肝脏中发现了12个重要的miRNAs，这些miRNAs被鉴定与鸡J亚群禽白血病肿瘤的形成相关，其中gga-let-7b/7i、gga-miR-125b、ggamiR-221/222和gga-miR-375在J亚群禽白血病肿瘤形成过程中起抑癌基因的作用，gga-miR-1456、gga-miR-1790和gga-miR-2127起致癌基因的作用[22]。利用双链RNA引起同源miRNA降解，从而导致基因表达沉默的现象，即RNA干扰，可以更好地减轻ALV-J的致病效应[30]。

目前在ALV-J防治方向上，miRNA原理和重组技术研究有了较好的突破。研究人员构建了靶向env基因保守序列并转染DF-1细胞的miRNA重组真核表达载体，发现感染细胞的ALV-J受到了有效的抑制，提示miRNA重组技术可以作为新的治疗方向[31]。

2.4 高致病性禽流感禽流感是由A型流感病毒引起的以呼吸系统症状或严重的全身性、出血性、败血性症状为主要表现的急性和高度接触性禽类传染性疾病。自2004年首例禽流感在中国大陆暴发以来，禽流感疫情就成为我国家养禽类养殖的最大威胁。高致病性禽流感（highly pathogenic Avian influenza，HPAI）是由正粘病毒科、A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）H5或H7高致病力亚型毒株（以H5N1和H7N1为代表）引起的，占我国禽流感疫情的90%以上[32]，发病率和死亡率都很高，被列为A类动物疫情。HPAI最初以鸡为主，并且过去已经分离到多株对鸭致死率为零而对鸡和火鸡达100%的禽流感病毒。但从2000年开始，中国部分地区的鸭、鹅、鹌鹑等禽类出现了感染，表现为全身器官和组织的严重出血[33]。最近研究显示，AIV可在鸡和鸭群中相互传递，最重要的是鸭可长期携带原始或发生了多次重组的AIV，这使得看似健康的鸭体内隐藏有不断变异的 H5N1 AIV，并越来越具有致命性[34]。

A型流感病毒在病毒复制和致病过程中发挥主要作用的是基因组编码的PB1、PB1-F2和N40蛋白，靶向这几种蛋白是HPAI的主要治疗方法。研究人员筛选300个在鸡肺脏中表达的miRNA发现，gamiR-133c、gga-miR-146c和gga-miR-1710 能够靶向这3种蛋白基因，从而推测以上3种基因在HPAI的防治中存在参考应用价值[35]。miRNA通过与靶标基因不同程度的结合，在转录后以不同方式发挥负调控作用。转录因子在转录的不同阶段，与miRNA共同调控以促进或抑制基因的转录与翻译过程。因此，miRNA和转录因子的共调控作用在探索HPAI的发生中十分重要，尤其是在疾病的预防和治疗方面[36]。

研究发现蛋鸡和肉鸡在AIV感染后miRNA表达存在差异，感染组肉鸡肺脏中具有更多的miRNA（108种miRNA）高表达，推测肉鸡中可能存在不同的miRNA调控机制。李泽中等[37]应用高通量测序技术和生物信息学方法，分别分析了感染鸭感染高致病性禽流感病毒（highly pathogenic Avian influenza virus，HPAIV）后的鸡与鸭的脾脏、胸腺和法氏囊的miRNA。结果显示，鸡和鸭免疫器官的保守miRNA在表达水平上具有较大的组织特异性差异。鸭感染HPAIV后拥有低于鸡的免疫器官差异表达的miRNA，感染鸡与SPF鸭的脾脏和法氏囊的miRNA表达的相关程度较高，而胸腺的表达差异则较大，推测鸡胸腺的功能在感染HPAIV后受到抑制。靶基因预测技术和miRNA表达分析的应用，以及通过对鸭脾脏的数字基因表达谱的分析，构建了鸡、鸭miRNA的调控网络，同时研究了免疫相关通路在鸭感染HPAIV时调控上的变化，上调的基因富集在JAK-STAT、WNT、RIG-like和Toll-like等通路。

研究AIV感染与miRNA间的调控关系，帮助理解AIV与miRNA在致病宿主细胞上的关系，为AIV防治新思路的开拓提供了重要的理论和实践基础。

2.5 新城疫新城疫（newcastle disease，ND）是一种急性、高度接触性禽类传染病，由属于副黏病毒科、副黏病毒亚科的新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起。NDV为单链负股RNA病毒，包括强毒株和弱毒株两类。ND根据临床发病特点分为典型和非典型两种，被国际动物卫生组织列为A类动物传染病。自1926 年至今，世界上共发生过4次广泛流行的NDV，且每次流行都有新的基因型出现，表明疫苗的选择压力可能会诱发NDV产生抗原变异[38]。ND主要危害野鸡、珠鸡、火鸡、鸭、鹅、麻雀等禽类，可引起消化道和呼吸道的严重感染，并具有急性、高度致死性特征，甚至导致鸡全群死亡[39]。ND的预防策略主要是通过疫苗接种，可基本保证避免大规模流行的发生，但随着非典型新城疫的出现和疫苗接种强度和密度的增加，出现了以地区散发性和非典型性为特征的新的流行特点[40]，使得免疫失败常常发生，急需研究出新的防治手段。

双链RNA诱导的转录后基因特异性沉默机制可针对生物体对抗外来基因入侵进行保护，广泛存在于从低等原核生物到植物、真菌、无脊椎动物的双链RNA中。选择Psi-L3、Psi-L7和Psi-N2三个对NDV抑制作用比较好的靶位点，依据Invitrogen公司提供的miRNA设计原则，设计合成了3对克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体上的寡聚核苷酸,且均含有miRNA序列，同时以此为基础构建miRNA串联表达质粒P-N2-L7-L3。研究结果表明串联表达的miRNA能协同抑制NDV的复制[41]。

满朝来等[8]发现利用NDV La Sota弱毒株疫苗免疫7日龄海兰褐雏鸡14 d后，pri-miR-181b1的表达活性在除雏鸡法氏囊以外的免疫组织中均未上调，同时miR-181b1已被证实在NK细胞（natural killer cell）发育和功能活性上起促进作用[41]，因此推测新城疫弱毒株疫苗参与免疫应答的机制，可能与诱导免疫相关的miRNA有关联。

研究NDV感染与miRNA串联表达的调控关系，可为在疫苗失效条件下为NDV防治提供新的思路。

3 小结与展望

非编码RNA的研究近年越来越受到重视，同时也取得了较大进展。鸡因为其简单的基因背景和便于操作等优势成为现代分子生物学研究的重要模式动物之一。当前已被广泛研究的主要是禽类疱疹病毒，它可通过感染宿主细胞来改变miRNA的表达活性，主要包括细胞内源miRNA、编码基因或病毒编码miRNA。其他病毒如何影响miRNA还不甚了解，具体的致病机制和治疗预防仍需要深入研究。相信“禽类病毒-miRNA-细胞”这一机制模型将会给人们带来更多福音。