巨核细胞发育和血小板生成的调控机理及巨核细胞和血小板的临床应用*

陈子兴

(苏州大学附属第一医院，江苏省血液研究所，卫健委血栓与止血重点实验室， 江苏 苏州 215006)

血小板是血液中行使凝血和止血功能的重要成分，近年来研究发现血小板还有日益增多的各种功能。血小板的数量和功能缺陷本身可导致某些疾病，而某些疾病中出现的血小板数量和功能缺陷，也严重影响疾病的预后。自1906年首次确认血小板来源于巨核细胞后，血小板的各种病理改变就必然与巨核细胞的发育成熟过程密切相关。本文拟对造血系统中巨核细胞系列的发育成熟和血小板生成释放的过程及其调控机理，以及在多种疾病中针对巨核细胞、血小板的靶向干预策略做一简明扼要的综述，使读者获得此领域比较全面综合的理解。

1 巨核细胞发育分化和生成血小板的过程

巨核系祖细胞起源于由造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)定向分化的巨核-红系双向祖细胞(megakaryocyte-erythroid progenitor,MEP), 增殖的巨核系祖细胞终末分化成巨核细胞, 并实现细胞质的成熟和细胞核的核内有丝分裂(endomitosis)，最后生成血小板。巨核细胞的成熟分化过程称为巨核细胞生成(megakaryopoiesis)。 而由巨核细胞产生血小板并释放的过程称为血小板生成(thrombopoiesis)[1]。在哺乳动物胚胎发育过程中，初始巨核细胞(primitive megakaryocyte，pMk)分别在初始造血(primitive hematopoiesis)时的卵黄囊中和定型造血(definitive hematopoiesis)时的胚肝中出现，出生后在成人骨髓中产生。巨核细胞(megakaryocyte，Mk)起源于具有自我更新能力的多能造血干细胞定向分化而成的Mk祖细胞。早期Mk祖细胞是含有能产生Mk/血小板的HSC克隆和具有红系/Mk双向潜能的祖细胞克隆的异质性群体。经过数次细胞分裂分化成表达血小板特异性抗原(CD41/CD42)的原巨核母细胞(promegakaryoblast)。这些二倍体(2N)细胞通过多倍体化阻滞，扩增细胞质和形成更多细胞器，从有丝分裂状态转换成核内有丝分裂状态而形成多倍体的巨核母细胞和巨核细胞，并重构细胞骨架而形成伪足，成为原血小板(proplatelet)。成人巨核细胞分化发生在骨髓中，而血小板的形成和释放发生在外周血和骨髓窦中，延伸的伪足状原血小板通过内皮屏障时断裂成为血小板，这过程被认为发生在肺循环血流中。

人类胚胎和新生儿的巨核细胞与成人巨核细胞在细胞的体积、细胞染色体的多倍体性、细胞分裂增殖的速度、表面抗原和细胞因子的表达以及产生血小板的效率等表型都有显著区别[2]。血小板的产生与Mk的数量和体积有关。Mk通过核内有丝分裂，即连续几轮DNA复制而不分裂，成为多倍体(可达64N，一般形式为16N)而呈体积巨大并含有多分叶核的成熟巨核细胞，其主要结构特征包括由分叶核之间胞膜内折延展而成的分界膜系统(demarcation membrane system，DMS)，细胞质扩展伴随α和致密颗粒增多，致密的管网结构形成开放管道系统以释放颗粒。DMS作为生成原血小板的膜性储存池与骨髓窦间隙相通，使分叶核节段化而最后加工成血小板，释放到血流中。虽然巨核细胞是高倍体细胞，但高倍体并非产生血小板的先决条件，实验证明胚胎中2N巨核细胞和脐血中的2N和4N巨核细胞都能产生血小板[1, 3]。

2 巨核细胞和血小板的生物学表型和功能

2.1巨核细胞的表型和功能 Mk直径从胚胎的14～15 μm，逐步增大到成人骨髓Mk的21.9 μm。新生儿和婴儿的Mk有较大和较小2个群体，发育到4岁的幼儿绝大多数就成为大Mk了。成人外周血中大于8N的Mk占40%，骨髓64N以上的Mk占68%，而Mk细胞分裂速度显著降低，反映Mk核内有丝分裂增强所致多倍体增多。虽然胚胎Mk体积增大和多倍体形成尚不充分，但其Mk/血小板特异性因子、细胞表面受体和Mk内颗粒成分的表达已经上调[2]。 胚胎和成人Mk表达的integrin α-IIb(CD41)、integrin β3(CD61)和糖蛋白Ib α(CD42b)水平相似, CD42b复合物代表着分化晚期的Mk细胞标记。脐血来源的Mk祖细胞还表达大量的血小板蛋白血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)和P-selectin。胚胎和成人Mk最大的表型差异是产生血小板的效率，成人外周血Mk产生原血小板和血小板的能力是脐血Mk的3倍。这种差异主要因为胚胎Mk体积小而多倍体化尚不足。

来自红系/Mk双向祖细胞的原始巨核细胞(megakaryoblast)经过数次细胞分裂，细胞质内即开始表达血小板特异性蛋白，如β1-tubulin,细胞膜表面逐渐出现一系列血小板特异性黏附蛋白，如integrin α-IIb /β3、integrin α-II/β1、GPIb和GPVI，细胞质里出现组装的颗粒内含物，如PF4、TGF-β、vWF和P-selectin,产生原血小板的细胞内膜开始形成。再经过4～6次细胞分裂，有丝分裂开始停滞在分裂前期，出现核内有丝分裂，导致Mk呈高度多倍体。在此期间，所有血小板特异性蛋白基因均同步化转录，产生大量血小板特异性关键蛋白。伴随细胞内膜的外鞘形成，肌动蛋白构成的细胞骨架断裂，β1-tubulin的长纤维伸出，原血小板分节段而成为血小板[1]。核内有丝分裂所致的Mk高度多倍体对生成足量血小板非常关键，如果2N的Mk能产生2个血小板，经过3次有丝分裂的16个2N Mk也仅产生32个血小板，而经核内有丝分裂产生的16N的Mk能产生多于2 000个血小板。由此可见，血小板数量和质量异常，以及血小板功能蛋白的缺陷均可溯源至巨核细胞系列的发育过程。

2.2血小板的生物学表型和功能 血小板为血液中去核的细胞质片状结构,它虽然无细胞核，但携带充分的遗传物质(包括线粒体)，频繁进行各种生命活动并实施多样生物学功能，除了凝血和止血外还包括参与抗微生物的宿主防卫功能，分泌炎性细胞因子和帮助组织修复的细胞因子等。血小板从巨核细胞生成后，也会经历衰老、凋亡而被清除的过程，因此每天连续产生和清除1011血小板才能保持体内血小板在(15～40)×104的稳定水平。生成和清除过程之间的任何不平衡均会导致血小板数的过多或过少，而产生病理后果(出血或栓塞)。血小板的产生、存活和增殖的主要调控者是血小板生成素(thrombopoietin，TPO)及其介导的分子机理, 此外，骨髓微环境(龛位)也是影响血小板生成的重要因素。Mk细胞的成熟和血小板形成有赖于Mk细胞由成骨母细胞龛位移行到血管旁龛位。一旦Mk细胞成熟，就延伸出呈伪足状突起的原血小板穿过髓窦内皮细胞层的细胞间而断裂成血小板进入血流[4]。肝细胞为TPO的主要来源。血清TPO水平与血小板数呈负相关。动物模型显示TPO通过结合Mk细胞和血小板表面的Mpl 受体及与之结合的JAK2和DNM2激活细胞内通路，刺激双向Mk祖细胞分化而产生血小板，同时又通过 Mpl限制TPO过度刺激而防止Mk细胞过度增生。调节血清TPO水平的还有其它多种因素，如血小板减少症时骨髓基质细胞会产生TPO，多种炎症状态(溃疡性结肠炎、类风湿关节炎和卵巢癌等)也会增高血清TPO水平导致血小板增多。近年来研究突出了骨髓微环境对巨核细胞成熟和血小板产生的作用。成骨性龛位中的collagen I 与Mk表面integrin α-II /β1的相互作用抑制坐落于其中的Mk细胞产生血小板。随着Mk细胞移行到血管旁龛位而成熟，它们与髓窦内皮细胞相互作用生成穿越内皮细胞间隙的原血小板，并最终形成血小板进入血液循环。Mk细胞在龛位中的定位和移行由髓窦内CXCL12和Mk细胞表面的CXCR4，以及内皮细胞的VCAM-1和Mk细胞表面integrin α-IV /β1的相互作用来调节[4]。

血小板的清除可通过2种主要途径，一是通过衰老诱导的信号来清除，即膜表面糖链的降解而启动凋亡，血小板唾液酸酶Neu1和Neu3表达上调使血小板表面唾液酸丢失，特别消化vWF受体复合物GPIbα上糖链中的众多唾液酸，使暴露的下层半乳糖残基易于被金属蛋白酶所降解而启动凋亡。发生去唾液酸化而衰老的血小板，被肝细胞的Ashwell-Morrell受体清除，并由JAK2和STAT3信号通路介导反馈促进肝脏合成TPO和增加血小板的生成。另一途径是通过抗体介导的免疫反应来清除。自身抗体所致的血小板清除最典型的发生在特发性血小板减少性紫癜，主要针对血小板表面的糖蛋白integrin α-IIb /β3(GPIIb-IIIa)和GPIb-IX复合物。破坏的血小板在脾脏由巨噬细胞，也可能在肝脏由Ashwell-Morrell受体清除之。

Mk细胞的存活有赖于Bcl-2家族蛋白MCL-1和BCL-XL对内源性凋亡通路的有效管束。对MCL-1敲除小鼠模型，给予ABT-737(BCL-XL抑制剂)即促发巨核细胞快速凋亡。体外培养的巨核细胞凋亡有利于血小板的生成和释放，血小板产生的峰值与成熟Mk细胞凋亡的峰值重合。小鼠模型显示一旦巨核细胞的细胞质离散为血小板，Mk细胞就发生凋亡。血小板的生命期在人类是8～10 d，在小鼠是4～5 d。决定血小板生存期的决定因素是BCL-XL，其缺失显著减少血小板的存活期，而与其下游BAK/BAX联合缺失则延长血小板的存活期[5-6]。

近年来不断增多的证据提示血小板还与恶性肿瘤的转移有关，临床前和临床研究提示血小板通过与肿瘤细胞的各种相互作用可促进肿瘤的形成和转移。肿瘤细胞直接与血小板聚集，促发血小板颗粒释放，改变血小板的表型和RNA表达谱，促进血小板增多。反之，血小板推动肿瘤细胞的增殖，激活抗凋亡和血管生成信号通路，并通过诱导肿瘤细胞的上皮-间充质转化表型而激发肿瘤细胞的侵袭，维持其转移灶，并促进形成新的转移灶。这为阿司匹林等抗血小板药物在肿瘤治疗中提供了理论可能[7]。

3 调控巨核细胞发育成熟和血小板产生的分子机理

巨核红系祖细胞定向于巨核细胞系列而终末分化成能产生血小板的成熟巨核细胞的整个过程都受到严格的转录调节和表观遗传学机理的掌控, 而外部刺激的信号通路则启动和协调这些调控步骤。巨核祖细胞的定向分化过程至少有6种转录因子——GATA-1、GATA-2、Fli-1、RUNX1、FOG-1和 NF-E2发挥关键作用,它们参与调控巨核细胞系列特异性基因的表达而使之成熟形成血小板。其中GATA-1不但使初始多能祖细胞定向于红/巨核系双向祖细胞，还调控巨核细胞的发育分化，如颗粒和DMS形成。巨核细胞中，integrinα-IIb、GPIb,GPVI,GPIX和PF4基因启动子中都有供GATA-1和ETs 族转录因子(如FLi-1)结合的共有序列。RUNX1(即AML1或CBFα)的活性由多种信号途径(如MAPK)修饰调控，一旦激活，它与CBFβ组成的复合物就结合到共有序列TGTGNNN,促进多种巨核细胞特异基因(PF4，integrin α-IIb) 的转录，并促进细胞增殖。NF-E2在巨核细胞成熟的最后阶段发挥关键作用。另外一些转录因子则经由系统生物学分析获知, 如c-Myb 对MEP是定向于红系还是巨核系起决定性作用。 这些转录因子的表达水平主要由内源性信号决定。组蛋白乙酰化和甲基化介导的表观遗传学也影响着巨核细胞的基因表达态势，例如FOG的突变阻断转录因子与核小体重塑和去乙酰化酶复合物NuRD的相互作用，而导致灰色血小板综合征样的巨大血小板减少症。TPO与巨核细胞表面的受体c-Mpl结合后，激活一系列信号转导途径促进巨核细胞的存活、增殖和分化，这些信号途径包括MAPK、STAT、PI3K、PTEN、SHP1、SHP2和SHIP1以及细胞因子信号转导抑制因子蛋白。 此外, 还有更多的信号分子参与, 包括mTOR、β-catenin和G蛋白Rac1、Rho和CDC42,转录因子HIF-α、HOXB4和HOXA9, 以及下调的介导分子GSK3-α 和FOXO3[1, 8]。Mk核内有丝分裂而多倍体化的调控还涉及转录因子(如GATA-1、TAL-1、FOG-1、RUNX1、GFI1b和 NF-E2)，细胞周期调控分子，如cyclin D、E，以及CDK抑制分子(P27KIP1、P15INK4B、P19INK4D、P57KIP2)、aurora B、RhoA和 myosin IIB(MYH10)等。应用ChIP-seq分析脐血中巨核细胞中转录因子GATA-1/2、RUNX1、Fli1和 SCL在基因组中的结合位点，确认march2、max、smox、pttg1lp、emilin1和sufu基因对巨核细胞生成和发育具有关键作用[1, 9]。

巨核细胞与HSCs有许多相似的特征，其中最令人关注的是两者的维持和扩增都依赖于TPO-MPL信号通路的作用，两者还有相同的表面抗原，如CXCR4 和CD150，并有类似的基因表达态势，表明HSCs与红/巨核系祖细胞具有最密切的关系。单细胞分析揭示HSCs中有一群高表达vWF的HSC, 可能是最易于定向巨核细胞系列的细胞。最近的实验发现巨核细胞对HSC在龛位中保持静息发挥重要作用，在受外部刺激应激时(如化疗后)，巨核细胞还可能对HSC有反馈作用而促进HSCs的增殖和恢复[10]。

4 巨核细胞系列发育成熟和血小板生成的表观遗传调控

红系/巨核系祖细胞定向于巨核系发育分化中，系列特异性基因的表达除了受转录因子调控外，还受基因顺式元件(如启动子，增强子)的染色质构型开放性和可及性，以及miRNAs等表观遗传学机理的调控。Heuston等[11]对小鼠和人多潜能祖细胞(multipotent progenitor,MPP)、红系/Mk祖细胞和Mk定向祖细胞检测转录组和全基因组中开放型染色质H3K27ace的分布谱，显示Mk定向祖细胞与MPP非常相近，巨核系列基因表达谱和表观基因组景观在造血发育的早期就建立并存在于绝大多数MPP中。相比之下，红系表达谱和表观基因组在造血过程的晚期，对MPP的转录和表观基因组编程有较大改变后才确立。人类白细胞某些基因的甲基化态势改变与血小板的功能相关，最典型的例子是复杂印记基因簇GNAS的甲基化状态与血小板刺激G-蛋白(Gs)激活功能之间的关系。Gs由复杂印记基因簇GNAS编码，GNAS覆盖的3段甲基化区域分别来自父源和母源特异性表达的印记基因。GNAS区域的遗传或表观遗传异常导致一系列奇特表型的遗传病，如Albright 遗传性骨萎缩症、假性甲旁腺功能低下症Ia型及Ib型和双假性甲旁腺功能低下症，均伴有血小板Gs功能减退。这些GNAS甲基化态势异常而致的遗传病，因血小板Gs低功能而易聚集，可导致低龄缺血性脑卒中和心血管病[12]。

巨核细胞系列的分化还与染色质组蛋白的修饰有关，体外以组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase，HDAC) 泛抑制剂诱导CD34+HSC向巨核细胞系列分化时，Mk细胞的多倍体性显著下降，成熟缺陷，这提示HDAC既可能参与调控Mk细胞的核内有丝分裂所致的多倍体化，也可能与某些细胞骨架蛋白(如α-tubulin)的乙酰化有关。基因剔除小鼠模型还显示Asxl1、Tet2和Ezh2基因也与Mk系列的分化有关[9]。最近Yang 等[13]报告，作为使H3K9me2去甲基化的组蛋白去甲基酶JmjC家族的成员，PHF2也参与了红/巨核系列分化的表观遗传调控。

多种微小RNA(microRNA, miRNAs)参与巨核细胞生成和分化调控。miR-125b通过靶向作用于P19INK4D而参与巨核细胞的分化调控[14]。 miR-150靶向降低c-Myb表达而促使红/巨核系祖细胞向巨核细胞方向分化。Mk的成熟分化与miR-150的表达负相关。TPO刺激巨核细胞增殖时，miR-150表达水平上调。巨核细胞生成中起作用的还有miR-34a和 miR-27a。有研究者应用miRNA芯片还筛选到巨核细胞生成过程中miR-10a、miR-126、miR-106、miR-10b、miR-17和 miR-20表达下调。

5 巨核细胞系列调控机理异常所致血小板数量和功能异常的病理改变

巨核细胞发育分化过程的调控机制异常，导致产生的血小板数量和功能缺陷，从而产生与止血或血栓相关的病理改变，主要可分为家族遗传性血小板功能异常和恶性巨核细胞/血小板病两大类。最主要的巨核细胞发育分化调控机理的异常是转录因子突变造成的功能改变，而多种转录因子的突变既可导致家族遗传性血小板功能异常，又可导致恶性巨核细胞/血小板病。这些发生突变的转录因子包括RUNX1、Fli-1、GATA1、GFI1b、ETV6和 EVI1等。近年来应用二代测序(next generation sequencing，NGS)检测基因组景观的变化更深入地揭示了巨核细胞/血小板病理改变的分子机理。

5.1转录因子的突变所致的家族遗传性血小板功能异常和恶性血液病易感性RUNX1编码蛋白(即CBFα2、AML1)是调控胚胎定型造血不可或缺的转录因子，它与CBFβ 组成转录复合物调控一批Mk/血小板通路的基因(如ALOX12、PF4、MPL、MYH9和MYH10等)。RUNX1条件敲除小鼠模型的Mk分化成熟受损，出现异常的微巨核细胞和多倍体程度显著下降。RUNX1突变的患者血小板减少，聚集功能受损，有轻中度出血倾向，如出现更多基因(如CDC25C、GATA2、TET2、MLL2和RB1)的体细胞突变，预示着向急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)/骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)的恶性转化。RUNX1胚系突变可导致家族遗传性血小板功能异常，并显示AML/MDS的易感性[15-16]。

Fli-1基因属于ETS族转录因子的成员，在巨核细胞生成发育和血管生成中发挥关键作用。Fli-1敲除小鼠的胚胎死于出血。Fli-1缺损与Jacobsen syndrome (JS) / Paris-Trousseau syndrome(PTS)相关。此缺损可由亲本配子的原发突变产生，也可由染色体重排而基因易位所致。前者具有古怪面容，发育迟缓，多器官(心、肾、泌尿生殖道，神经和造血系统)异常。大部分JS者合并PTS，有出血倾向，先天性巨血小板减少症和血小板功能异常。骨髓中巨核细胞增多，出现小幼稚Mk细胞。近年用NGS还发现Fli-1可有不同点突变的变异体。

GATA1基因编码的锌指转录因子对红细胞生成和巨核细胞生成均起关键作用，它在红细胞、巨核细胞，肥大细胞和嗜酸细胞中都高表达。巨核细胞内许多基因的调控区都有GATA1结合模序。在多个出现别关性的联血小板和红细胞异常而表现为贫血和血小板减少的家族中检出GATA1不同形式的突变，如GATA1-V205M、D218Y、D218G和G208S等，破坏GATA1与FOG1相联或阻碍其结合到DNA上。β地中海贫血中的GATA1突变可致性别关联的血小板减少。有GATA1突变患者对胶原反应的血小板聚集降低，对瑞斯托酶素的凝集反应降低，GPVI及GPIb-IX-V复合物的表达减低。

锌指转录因子GFI1b通过对染色质构型实施调控而抑制靶基因转录，对红细胞生成和巨核细胞生成发挥关键作用，它表达于HSC, MEP和红、巨核两系列成熟细胞上。通过调控TGF-β信号通路控制MEP的系列特异性分化。GFI1b调控转录的靶基因有BCL-xL、SOCS1、SOCS3、CDKN1A、GATA3、MEIS1和RAG1/2。近年发现家族性GFI1B突变与血小板功能异常相关。GFI1b突变者呈轻中度血小板减少和不同程度的出血倾向，血小板聚集功能受损，GPIbα和GPIIIa表达下降。骨髓显示巨核细胞病态特征，巨核细胞/血小板表达的CD34增高[15]。

ETV6编码的转录因子属于ETS家族，其功能主要是抑制转录。ETV6对造血和血管网络形成有关键作用，ETV6敲除小鼠出现胚胎卵黄囊血管形成受损和神经基质细胞凋亡。ETV6支持HSC的存活，对巨核细胞的终末分化也很重要，纯合ETV6条件敲除小鼠的血小板数下降一半。杂合性ETV6胚系突变的家族出现遗传性血小板减少，巨大红细胞和恶性血液病。 Poggi等[17]对显性的血小板减少患者的细胞行DNA测序，检出6种ETV6变异体，它们可导致巨核细胞中原血小板的形成减少和细胞骨架异常，血小板体积和形状参差不齐，功能缺陷，患者伴有顽固性贫血和外周循环CD34+的祖细胞数增高。

锌指蛋白EVI1由位于染色体3q26.2上的MDS1/EVI1复合位点MECOM编码，其锌指结构可识别GATA样和ETS样的模序, 可与其它转录因子(RUNX1和GATA-1)相互作用。EVI1表达于HSC、Mk和血小板上，对HSC的自我更新具有根本的作用。EVI1敲除小鼠因出血、造血细胞稀少和基质结构破坏而胎死宫内；敲低HSCEVI1损害巨核细胞的分化，下调ITGA2b和ITGB3的表达。由MECOM突变而致EVI1蛋白异常的家族出现先天性桡尺骨骨性关节炎和巨核细胞性血小板减少症(radioulnar synostosis and amegakaryocytic thrombocytopenia，RUSAT):患者的尺挠骨先天融合，血小板重度减少，Mk显著减少甚至在骨髓中消失，患者最终骨髓衰竭而需造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplant，HSCT)挽救。某些患者还有HOXA11突变。在5%～10% AML患者中出现MECOM突变，成为预后不良标记。

除了上述转录因子基因的突变外，转录因子识别和结合的调控序列发生突变使RUNX1、Fli-1或 GATA1等转录因子不能与之结合，也会产生临床血小板减少。

5.2恶性巨核细胞/血小板病的基因组改变 多种恶性血液病或恶性血液病的前期即发生Mk和血小板异常，这些异常参与或反映了恶性血液病的发生机理并影响或成为疾病的预后指标。其次Mk系列本身的恶性转化就产生急性白血病。近年NGS等技术揭示这些涉及Mk和血小板异常的恶性血液病的基因组改变，以及Mk和血小板异常在这些疾病中的作用。

首先是Ph-MPN(骨髓增殖性疾病)，有进展为AML的高风险。按WHO分类为PV、ET和PMF，其中PV主要涉及红细胞系列增多，ET和PMF的临床表现都涉及巨核细胞系列和血小板的异常，前者血小板增多,巨核细胞明显增殖而骨髓中无纤维化，而后者骨髓中巨核细胞过多并呈病态，伴有网状纤维和胶原纤维沉积。95% ET和50%～60% PMF中最主要涉及的基因组改变是体细胞获功能的点突变JAK2V617F，导致JAK2介导的TPO、EPO和C-CSF受体信号途径持续活化而不依赖于细胞刺激因子；其次是MPL的获功能体细胞突变(MPLW515L,MPLW515K),使巨核细胞不依赖细胞因子而对TPO高度敏感。还有编码Calreticulin的CALR基因也在约30%的ET或PMF中突变，其突变使CALR蛋白失去在内质网中的定位。突变的CALR通过MPL体质性地激活JAK-STAT通路，对 TPO高度敏感，导致巨核细胞群体扩张和血小板增多而类似ET。虽然大部分MDS患者血小板减少，5q-MDS患者的血小板计数却正常或增高，骨髓巨核细胞呈低分叶。 RARS-T是MDS和MPN中的一种较少见的表现，特点为病态红细胞伴有>15%环形铁粒幼红细胞，血小板增多和大型巨核细胞增殖。70%～90%的RARS-T都有RNA剪切基因SF3B1的突变，该基因编码的SF3B1是U2snRNP剪切子复合物的基本成分而参与RNA加工。在MPN中SF3B1突变的发生早于JAK、MPL和CALR突变。

急性巨核细胞型白血病(acute megakaryoblastic leukemia，AMKL)是AML的亚型之一，骨髓中出现原始巨核细胞和相当程度的纤维化，复杂染色体核型在AMKL中多见，如t(9;22)、-5/del5q、-7/del7q等，AMKL发病还与GATA1突变和DYRK1A、ERG、miR-125b的过表达相关[8]。

5.3遗传性血小板异常(inherited platelet disorders，IPD)的基因组异常 遗传性血小板异常通常表现为血小板数量和体积的改变，伴随血小板功能缺陷，包括血小板的黏附功能、聚集功能、凝集功能和应答生长刺激因子的受体和信号通路的缺陷等，其中Bernard-Soulier syndrome(BSS)是一种少见的血小板减少伴巨大血小板的病变，有血小板黏附功能缺陷所致的出血倾向。其血小板GPIb-IX-V复合物表达的质和量，及其与vWF结合能力缺损，综合基因组分析显示GPIBA、GPIBB或GP9基因位点共有112处突变，损害GPIb-IX-V复合物的组装。血小板分泌和聚集的信号通路缺陷可导致轻中度出血，其中编码G蛋白偶联受体GPCR蛋白的P2Y12、TBXA2R基因突变减弱了ADP或TBXA2诱导的血小板聚集。血小板中α和δ颗粒分泌的蛋白触发血小板的黏附和止血，而灰色血小板综合征是α颗粒分泌和蛋白包装储存缺陷的IPD，有轻中度出血、骨髓纤维化和脾肿大。NBEAL2基因突变被认为是其分子机理, 与红/巨核分化调控相关的转录因子GFI1b基因的无义突变也与伴红细胞缺损的灰色血小板综合征相关。与δ颗粒分泌、穿梭和释放缺陷相关的出血分别出现在Hermansky-Pudlak syndrome(HPS)和Chediak-Higashi syndrome(CHS)患者中，分别与编码合成溶酶体相关复合物的HPS1、HPS3-9、AP3B1基因缺损，以及LYST基因的移码或无义突变有关。活化血小板表面的integrinαIIbβ3(GPIIb、GPIIIa)与纤维蛋白原和其它黏附蛋白结合使血小板聚集。 血小板无力症(Glanzmann thrombasthenia，GT)患者编码GPIIb和GPIIIa的ITGA2B和ITGA3基因发生双等位位点突变，影响血小板聚集而导致严重出血。Phosphatidylserine由TMEM16F基因编码，在血管损伤时暴露而促发与凝血因子结合，最终产生凝血酶而形成纤维蛋白凝血块。在罕见的家族性出血病Scott syndrome患者有TMEM16F基因纯合或杂合性突变，影响Phosphatidylserine血小板膜表面的外化而损害凝血过程[8]。随着全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)的开展，过去30年来，共确认了51个基因的变异与IPD的发生有关，这些基因变异发生在巨核细胞早期定向分化、晚期分化成熟和原血小板生成3个阶段，影响血小板的生物表型或功能[18]。胚细胞中RUNX1基因突变与家族遗传性血小板异常相关，并伴有髓系恶性疾病的易感性，往往会进展为MDS/AML[16]。

6 以巨核细胞和血小板为靶点或介导载体的临床应用策略

6.1巨核系祖细胞的识别和分离 近年来巨核细胞和血小板被临床应用作为对某些疾病治疗的靶点或运载工具。而其前提首先是识别和分离巨核细胞。与理论上经典的红/巨核系祖细胞不同，Miyawaki等[19]以CD41为阳性标记在CD34+CD38+IL-3RαdimCD45RA-的CMP群体中分选出单向巨核系祖细胞MegP,能高频率地活跃分化成巨核系列细胞，比经典红/巨核系祖细胞的效率高得多，在ET中含JAK突变的CD41+MegP群体显著扩张。这就为临床应用前的实验操作提供了可分离的巨核祖细胞群体。Brouard等[20]进一步发现，小鼠胚肝中含CD45-CD31-TER119-CD51+VCAM1+PDGFRα-(V+P-) 标记的基质细胞群体提供的微环境能有效支持巨核祖细胞的产生和克隆扩张。与V+P-细胞共培养所得的巨核细胞呈多倍体性，含CD41/42c+,并能产生大量原血小板。

6.2以巨核细胞为对象的基因干预和治疗 对巨核细胞和血小板的应用主要有以下策略：以分离到的MegP行体外实验，研究促进巨核系细胞分化和纠正血小板异常的基因干预操作和临床前研究，来改进许多疾病的状况。鉴于血小板参与多种生理过程，如止血、免疫反应和创伤愈合；也参与多种疾病的病理机制，如动脉硬化、血栓形成和肿瘤细胞的转移；而无细胞核的血小板只有被血管损伤等应激环境激活后才发挥功能，因此要对血小板的缺陷功能进行纠正或改造，必须对其源头(HSC、HPC或巨核细胞)细胞实施基因操作，且需考虑这些血小板中功能基因表达的最佳时间。有一批巨核细胞特异性基因的启动子可供转入的外源目的基因实施转录，这些基因包括GPIBA-GPIX-GPV复合物、ITGA2B(GPIIb)、GPVI、c-mpl和PF4。这些启动子在巨核细胞早、中期由转录因子GATA-1、FOG-1、Ets(Fli-1)结合而实施基因表达的调控。它们驱动的基因在巨核细胞中持续表达到高水平，因此很适合驱动外源基因在巨核细胞中的表达，而对HSC或巨核细胞的基因转导目前以慢病毒载体为最适。

以上述策略靶向巨核细胞的基因治疗，旨在纠正基因缺损所致的家族遗传性血小板病，例如Scott syndrome中的TMEM16F，Stormorken syndrome中的STIM1/ORAI，Wiskott-Aldrich syndrome中的WASP和GP syndrome中的GFI1b[21]。对2例GT患者实施的基因治疗，以逆转录病毒载体介导将以ITGA2B启动子驱动的正常ITGB3cDNA转入患者CD34+PBSC中，使之在19%后代巨核细胞中表达出正常水平39%的integrin αIIβ3受体，足以纠正患者的出血症状，成功展示了以基因置换策略治疗遗传性血小板病的可行性[22]。近来又报导了对iPSC转基因治疗GT的策略。对血友病A应用AAV载体介导对HSC实施FVIII转基因的治疗在动物模型中取得止血效果。有人尝试用巨核细胞特异性ITGA2B启动子构建含FVIII或vWF的慢病毒载体对血友病A动物实施转基因HSC移植，结果显示血小板表达的FVIII储存在α颗粒内并释放，纠正了血友病A动物的出血。当前靶向巨核细胞的基因治疗还面临着许多问题和挑战，包括转基因的巨核细胞可能影响血小板的产生和改变血小板部分功能，对巨核细胞的转基因可能造成不可预测的插入性突变，导致机体对转基因巨核细胞的免疫反应等，有待克服和改进。

6.3以血小板介导的对肿瘤诊断和治疗策略 以血小板为载体可释放抗肿瘤(抗血管生成)分子到肿瘤微环境中抑制肿瘤细胞的增殖。有报告对肿瘤患者输以预载了化疗药物或纳米颗粒的血小板获得肯定的结果；又有报告以CMV启动子驱动抗血管新生蛋白tumstatin基因表达的慢病毒载体转导CD34+HSCs后，成功分化的巨核细胞能合成外源tumstatin并存储于血小板α颗粒而释放之，在体外对肺癌细胞有抗血管生成的效应[21]；以肿瘤细胞共育的血小板可作为非侵入性分子指标在液态活检中检出肿瘤并监测肿瘤的进展[23]；血小板来源的微颗粒(platelet-derived microparticles，PMPs)与肿瘤转移相关，循环中的PMPs可与肿瘤(血管)细胞相互作用而将血小板miRNAs传递给肿瘤细胞。Michael等[24]展示PMPs可浸润到人或鼠的实体瘤灶中，在体内或体外将miRNA(主要是miR-24)传递给肿瘤细胞(肺或大肠)而抑制细胞增殖并导致细胞凋亡，表明血小板可作为介导抗肿瘤物质的运载工具。

7 结语

巨核细胞和血小板是整个造血系统的重要成分，具有特殊的重要生理功能，也参与许多严重疾病的病理过程。相对于红系和髓系造血细胞的研究，目前对此领域的研究尚不够充分，有待更系统和深入的研究，近年来对它们的功能有许多新认识。希望本文引起读者对巨核细胞血小板系统发育分化机理和相关疾病的兴趣和关注，以推动此领域的基础研究和临床转化。