人参皂苷Rh2免疫调节作用研究进展

黄容容 钱 颖 向 明

(华中科技大学同济医学院药学院生物药学系，武汉 430030)

人参皂苷Rh2是一种四环三萜类皂苷单体，按结构分类属于二醇型人参皂苷(Protopanaxadiol，PPD)，是人参中的稀有皂苷[1]。Rh2最早发现于红参中，后来亦在西洋参、三七等多种中药中分离得到[2]，目前Rh2的获取方法有提取分离法、酸处理转化法和生物转化法[3,4]，这些技术为Rh2的工业生产奠定了基础。药理学研究表明Rh2对免疫系统、中枢神经系统、内分泌系统、心血管系统等均有调节作用，具有抗肿瘤、抗过敏、抗抑郁、抗衰老及改善心肌缺血等功效[5,6]。由于免疫系统在许多人类疾病的发生发展及转归中扮演重要角色，因此Rh2的免疫调节活性研究及其在防治免疫性疾病中的应用价值引起人们的关注。在抗肿瘤方面，Rh2不但可以通过促进肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期等机制抑制多种肿瘤的发展[7,8]，还可以增强机体抗肿瘤免疫应答、改善化疗药的免疫抑制作用[9]。Rh2还有显著的抗炎作用，可以抑制细菌内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎症反应，并对阿尔兹海默症、过敏性哮喘、过敏性皮炎等具有潜在治疗作用[10,11]。本文就Rh2在免疫调节方面的作用作如下综述。

1 Rh2对肿瘤免疫的调节作用

目前Rh2肿瘤免疫调节作用的研究主要集中于对肿瘤微环境中免疫细胞功能及细胞因子分泌的影响，表现为促进T淋巴细胞增殖，诱导肿瘤周围M2型巨噬细胞向M1型分化，增强NK细胞、CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，调节肿瘤微环境中的细胞因子分泌等。

1.1Rh2增强肿瘤环境中效应性T细胞活性 免疫反应是机体对抗肿瘤的基本途径，效应性T淋巴细胞是免疫反应中具有抗肿瘤作用的最主要的效应细胞之一，分为CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。CD4+辅助性T细胞通过促进B细胞活化、激活NK细胞等杀伤肿瘤细胞，CD8+细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)通过分泌能介导肿瘤细胞溶解或凋亡的穿孔素/颗粒酶、TNF-α、IFN-γ等直接或间接发挥抗肿瘤作用[12，13]。

研究发现Rh2可以促进黑色素瘤小鼠肿瘤组织中CD4+T和CD8+T淋巴细胞浸润，增加肿瘤周围T细胞数量；同时该研究的非放射性细胞毒性实验发现与模型组小鼠相比，Rh2处理组小鼠T细胞具有较高的杀伤活性，提示Rh2提高肿瘤周围T细胞数量的同时还能增强T细胞活性[14]。Rh2及其主要代谢产物R-PHQ和S-PHQ上调环磷酰胺诱导的免疫功能低下小鼠的免疫应答：Rh2阻止荷瘤小鼠免疫器官萎缩，促进ConA刺激的脾细胞增殖，恢复CD4+/CD8+T比例，并抑制CD4+CD25+T细胞水平[15]。临床研究表明Rg3可以上调鼻咽癌放疗患者的CD4+T/CD8+T细胞比例，Rh2是Rg3体内降解的主要活性产物，这提示Rh2也可能增加鼻咽癌患者的CD4+T、CD8+T细胞[16]。另外，Rh2的硫酸化修饰产物Rh2-B1激活CD8+T细胞株CTLL-2中p38MAPK和ERK依赖的信号通路并抑制p56 Lck和STAT5蛋白表达，从而促进CTL-2细胞增殖和IFN-γ的分泌，增强抗肿瘤免疫应答[17]。

1.2Rh2调节肿瘤相关巨噬细胞表型及活性 巨噬细胞是非特异性免疫防御的重要成员，具有吞噬、递呈抗原，调控局部组织微环境等多种功能，按作用及所处环境不同可分为M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macroph-ages，TAMs)等[18，19]。TAMs存在于肿瘤组织中，在肿瘤微环境下TAMs向M2型极化促进肿瘤的发展与转移，M1型巨噬细胞可通过分泌活性氧和氮中间体来杀死肿瘤细胞，同时分泌TNF-α和IL-1β招募CTL来攻击肿瘤细胞[20]，研究表明逆转肿瘤组织TAMs向M1极化，有助于抑制肿瘤生长[21]。

Li等[22]报道，Rh2通过调节TAMs与非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)之间的相互作用阻止肿瘤迁移和侵袭，用Rh2处理TAMs与NSCLC共培养的细胞系A549、H129，发现Rh2减少M2型巨噬细胞标记物CD206分子和血管内皮生长因子VEGF，增加M1型巨噬细胞标记物CD16/32分子，同时减少NSCLC中基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)MMP2和MMP9。除了Rh2外，另有研究报道参芪扶正注射液也有促进TAMs向M1型极化的作用[23]。Rh2还可以增强环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的巨噬细胞吞噬能力，H22荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬能力和碳清除率测试结果显示，与环磷酰胺组比较，Rh2及其代谢物R-PHQ和S-PHQ预处理组增强腹膜巨噬细胞的吞噬功能和碳清除指数[15]。

1.3Rh2增强肿瘤周围NK细胞毒性 NK细胞是一种非特异性免疫细胞，其抗肿瘤方式包括直接杀伤肿瘤细胞和介导T细胞杀伤肿瘤：一方面，NK细胞识别靶细胞后释放颗粒酶B和穿孔素，穿孔素在肿瘤细胞膜上形成“孔道”使水、电解质和颗粒酶B进入肿瘤细胞，从而直接诱导肿瘤细胞凋亡；另一方面，激活的NK细胞促进DC成熟，诱导Th1细胞极化并提高细胞毒性T细胞的杀伤活性，从而介导特异性抗肿瘤免疫[24，25]。文献报道人参总皂苷能提高肝脏肿瘤组织中浸润NK1.1+细胞数量，上调NK细胞穿孔素、颗粒酶B释放，从而增强对肿瘤的杀伤作用[26]。H22荷瘤小鼠的NK细胞活性处于严重低下状态，而人参皂苷Rh2干预处理明显增强NK细胞杀伤活性[27]。从健康女性的外周血中分离出NK细胞，用二醇型人参皂苷PPD处理，发现NK细胞群(NKG2A)的受体NKp30、NKp46增加，IFN-γ产生增加，IL-10表达降低[28]。

1.4Rh2调节肿瘤微环境中细胞因子分泌 肿瘤微环境中的细胞因子极为复杂，按功能不同分为两大类：一类是促炎症细胞因子，包括IL-2、IL-7、IL-12、IFN-γ、TNF-α等；另一类是抑炎症因子，包括IL-10、IL-13和TGF-β等[29]。促炎症细胞因子由T细胞、M1型巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞产生，其中IL-2、IFN-γ、TNF-α在抑制肿瘤生长过程中起着重要作用：IFN-γ主要由活化T细胞产生，能激活巨噬细胞，诱导TNF-α的表达从而杀伤肿瘤细胞[30]；TNF-α由巨噬细胞、肿瘤浸润的CD8+T细胞和NK细胞产生，促进肿瘤凋亡[31]。抑炎症因子由Treg、M2型巨噬细胞、髓系抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)等免疫抑制细胞和肿瘤细胞产生，具有抑制免疫和促进肿瘤生长的作用：例如IL-10、IL-6、TGF-β抑制DC成熟，抑制效应性T细胞及NK细胞活化，同时诱导MDSCs增殖，造成肿瘤细胞免疫逃逸[32]。

有研究报道Rh2有效抑制人白血病细胞HL-60和多种肿瘤细胞如K562、A549和MCF7的生长增殖，微阵列分析发现Rh2明显上调HL-60的TNF-α表达，抗TNF-α抗体减弱了Rh2诱导的细胞凋亡，提示Rh2通过TNF-α信号传导途径诱导细胞凋亡[33]。Wang等[34]报道Rh2上调结肠癌小鼠血清中IL-6、IL-18、TNF-α的分泌水平，缓解肿瘤相关的免疫抑制现象，延长结肠癌小鼠的生存期。Han等[35]报道20(S)-Rh2通过抑制JAK2/STAT3通路和MMP-1、MMP-2和MMP-9的表达而抑制结肠癌细胞侵袭，IL-6刺激HCT116细胞显著增加JAK2的酪氨酸磷酸化，20(S)-Rh2处理则抑制这种磷酸化，表明Rh2能抑制炎症环境下的肿瘤生长[35]。

2 Rh2治疗炎症相关免疫性疾病

炎症是机体自身的防御反应，适度炎症有利于机体抵御感染、异物入侵、清除损伤组织等，但过度炎症则会导致组织损伤和多种疾病的发生，即造成炎症相关免疫性疾病，例如变态反应、阿尔茨海默症(Alzheimer′s disease，AD)等，异常严重时甚至导致器官衰竭。研究发现Rh2具有抗炎作用，对AD、变态反应等炎症相关免疫性疾病有治疗作用。

2.1Rh2抑制细菌内毒素诱导炎症反应 巨噬细胞既是机体重要的固有免疫细胞，又是介导炎症反应的主要细胞之一。LPS通过巨噬细胞表面TLR4受体激活细胞进而促进炎症介质释放，引起巨噬细胞中iNOS、COX-2的高表达和NF-κB信号通路的活化，炎症蛋白和PGE2过量产生，促炎症细胞因子NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等大量分泌[36，37]，进一步激活其他免疫细胞并释放相应的细胞因子，这些免疫细胞及炎性因子过度堆积造成组织炎症及免疫疾病的发生。而抑炎因子IL-10和TGF-β能够抑制炎症细胞因子的产生，降低LPS造成的炎症反应和组织损伤。

据报道富含人参皂苷Rh2的人参根部水提物可以抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放活性氧(ROS)[38]，推测Rh2对细菌内毒素引起的炎症反应具有抑制作用。而另外几项研究报道证实了上述的推测，其中Bi等[39]报道增加水溶性基团修饰后的Rh2-B2显著抑制RAW264.7巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-1β的释放，同时增加IL-10的产生，其作用机制是Rh2-B2显著抑制p38 MAPK和c-Jun N末端激酶的磷酸化以及NF-κB入核，通过阻断丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB信号通路抑制由LPS诱导的巨噬细胞炎症[40]。除此之外，Rh2能够抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中PGE2、ROS和原基质金属蛋白酶-9(pro-MMP-9)的产生，以及抑制人HaCat角化细胞ROS水平和MMP-9、MMP-2活性，抑制角质形成细胞中TNF-α诱导的MMP-9明胶酶活性[41]。由于LPS诱导的炎症反应参与感染性或部分自身免疫性疾病(例如炎症性肠病)的病理进程，因此Rh2的抗炎功效提示其可能在防治该类疾病上具有一定的作用。

2.2Rh2对AD的治疗作用 AD是一种中枢神经系统退行性疾病，特征性病理改变为细胞外β淀粉样蛋白沉积、细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结以及小神经胶质细胞活化造成神经元损伤[42]。Aβ纤维能够诱发神经小胶质细胞介导的慢性炎症反应，激活的神经小胶质细胞释放毒性产物，包括前炎性因子、氧自由基、蛋白激酶、化学趋化因子和兴奋性毒素等，损伤周围神经元，从而引起神经元凋亡，突触丢失，进而发生神经退行性改变[43，44]。AD患者脑内老年斑周围大量活化的小神经胶质细胞和星形胶质细胞中核转录因子NF-κB增高，引起多种炎性相关基因的转录，促使炎症细胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β和NO等产生[45]；同时，环氧合酶COX1/2也参与了小神经细胞活化和PGs合成，对神经细胞造成炎性损伤[46]。总之，AD成因众多，免疫系统进行性衰竭和慢性炎症是重要的诱因及病理变化。

Qiu等[47]通过原代神经细胞和Tg2576转基因小鼠体内实验证明Rh2能调节淀粉样前体蛋白APP内吞作用，减少脑内Aβ积聚，改善Tg2576转基因小鼠的学习和记忆功能。Kumar等[48]报道Rh2可抑制LPS引起的炎症反应及小胶质细胞神经毒性，显著增加小胶质细胞中TGF-β的表达，降低NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2和iNOS的生成，有效地抑制小胶质细胞的活化和促炎细胞因子的产生，改善神经变性。Hou等[49]报道Rh2能显著降低三甲基锡(Trimethyltin，TMT)诱导的小鼠癫痫发作频率，同时Rh2处理能减少TMT诱导的星形胶质细胞死亡及炎症细胞因子IL-1α/β、IL-6、TNF-α、MCP-1的活化，保护少突胶质细胞并减少氧化应激和神经炎症，其作用机制是选择性上调PI3K/AKT通路和抑制ERK活化。

2.3Rh2对变态反应性疾病的治疗作用 变态反应是机体受到抗原刺激引起组织损伤或功能紊乱的病理性免疫反应，常发生于呼吸道、皮肤、消化道等部位，引发哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎、湿疹等疾病。过敏性哮喘是一种慢性炎症疾病，发病机制是过敏原与它们的互补免疫球蛋白IgE结合，激活IgE受体肥大细胞和嗜碱性粒细胞，致使Th1/Th2型细胞失衡，Th2细胞分化增加，炎症细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等产生增多[50，51]，进一步导致肺内嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞浸润[52]，在该过程中NF-κB参与Th2细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞及巨噬细胞的炎症反应[53，54]。过敏性皮炎是由过敏源引起的皮肤炎症，发病过程与过敏性哮喘类似，该过程有NF-κB/STAT6信号通路的参与[55，56]。

在过敏性哮喘小鼠模型中，Rh2减轻气道炎症反应，降低总卵清蛋白特异性IgE水平以及肺组织和肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13蛋白水平，增加IFN-γ蛋白水平，其分子机制是阻止小鼠肺组织IκB-α的磷酸化降解和NF-κBp65易位入核，抑制MAPKp38磷酸化，从而抑制炎症，缓解哮喘[57，58]。有报道Rh2抑制过敏性炎症：在小鼠接触性皮炎模型中，Rh2有效抑制耳肿胀，降低小鼠耳朵组织中COX-2、IL-1β、IL-4、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平，表现出抗炎和治疗过敏性皮炎的活性[59]。此外，Rh2可治疗LPS诱导的动物急性肺损伤，通过阻断iNOS、COX-2、IκB-α、ERK、JNK、p38MAPK、Raf-1和MEK蛋白的磷酸化，降低促炎介质NO、TNF-α、IL-1β的产生，发挥抗炎作用[60]。人参皂苷Rg3也可治疗小鼠急性肺损伤，显著抑制小鼠体内促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，同时防止抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的减少，降低肺部炎症[61]。

3 总结与展望

目前研究表明人参皂苷Rh2具有调节肿瘤免疫及治疗炎症相关免疫性疾病的活性或潜能。值得注意的是，Rh2在不同疾病背景中对免疫系统的调节作用不尽相同：在肿瘤微环境导致的免疫抑制情况下，Rh2提高CD4+T、CD8+T细胞比例，通过p38 MAPK通路激活CTL细胞并使其INF-γ产生量增加，Rh2作用于VEGF分子促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，产生TNF-α、INF-γ、IL-6等正向免疫因子，提高机体免疫应答；然而在炎症、AD、变态反应等免疫亢进情况下，Rh2通过COX1/2、NF-κB、p38 MAPK/JNK 和PI3K/AKT等信号通路抑制NO、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β等炎症因子水平，同时增加抗炎因子IL-10和TGF-β的产生，抑制机体免疫亢进。关于Rh2在肿瘤免疫和炎症相关免疫性疾病中对免疫细胞及细胞因子调节情况不同的疑问，根据现有资料推测这可能与不同疾病背景下Rh2对不同免疫细胞群具有选择性调节作用有关，具体原因有待探讨。

Rh2的免疫调节功能虽然得到了大量体内外实验数据的支持，但是其作用靶点及具体机制仍未得到完全阐释：一方面Rh2调节肿瘤免疫的分子机制(如调节巨噬细胞极化)有待进一步深入研究；另一方面Rh2具有的抗炎作用，提示其可能对感染性、慢性炎症性疾病(如2型糖尿病)及急性肺损伤等炎症相关免疫性疾病有防治作用，疗效尚需验证。此外，目前Rh2增强肿瘤免疫的药效学研究主要处于动物实验阶段，临床研究有待加强，以拓展其临床转化应用。