TAP1-637/LMP7-145基因多态性与漯河市农村妇女宫颈高危型HPV感染相关性研究①

宋佳玉 张清伟 孙明振 于江华 刘金宝 王慧芬 付秀虹

(漯河医学高等专科学校,漯河 462002)

高危型人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染是导致宫颈病变的首要病因，但大多数的HPV感染为一过性，仅少部分高危型HPV持续感染导致宫颈病变[1,2]。因此，宿主自身的免疫遗传因素在高危型HPV感染的发生和转归中起着重要作用[3]。抗原呈递通路作为机体自身的免疫监视系统，在机体防御高危型HPV入侵的过程中发挥重要作用[4-6]。抗原处理相关转运体(Transporter associated with antigen processing,TAP)和低分子量蛋白酶体(Low molecular weight polypeptide,LMP)作为该通路的关键位点基因多态性，是否与高危HPV感染存在相关性目前鲜有报道。本研究首次对漯河市农村妇女TAP1-637和LMP7-145多态位点进行检测，探讨其与高危HPV感染的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年9月～2017年12月漯河市农村妇女免费宫颈癌筛查中，确诊为高危HPV感染者258例和未感染者228例为研究对象，将其分为感染组和对照组。纳入标准：年龄25～65岁，性生活史>3年；月经干净3 d以上；取样前72 h无性生活及阴道用药；排除标准：无性生活史；既往诊断有宫颈病变史；有免疫性疾病、移植、恶性肿瘤放疗史；子宫已切除。本研究经河南省漯河市漯河医学高等专科学校第一附属医院医学伦理委员会批准，所有研究对象知情并均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1现场调查 采用专门设计的调查表对研究对象进行现场调查，内容包括年龄、种族、初产年龄、孕次和产次等方面情况。

1.2.2HPV检测方法 采用专用HPV采样器采集宫颈HPV标本。按照15种型别HPV测试剂盒(江苏中生方政生物技术股份有限公司)说明书，对15种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)DNA行半定量检测。阴性者为对照组，阳性者为高危HPV感染组。

1.2.3DNA提取 抽取外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸(Elhylene dia mine tetraacetic acid,EDTA)抗凝，-80℃保存。按照TaKaRa全血DNA提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)操作进行。

1.2.4引物设计 引物序列由武汉生物工程公司合成。见表1。

表1 设计引物Tab.1 Primer Design

1.2.5基因多态性检测 在聚合酶链反应(Polym-erase chain reaction,PCR)仪(ABI-9700，天津金思德生物科技有限公司)中进行PCR扩增反应，PCR扩增体系为20 μl，DNA模板2 μl(30 ng/μl)，2×PCR Taq Mix 10 μl(TaKaRa)，正反向引物各0.5 μl(10 μm/μl)，ddH2O 7 μl(日本TaKaRa Bio 株式会社)。PCR扩增条件：95℃预变性3 min，98℃变性5 s，退火30 s，退火温度分别为56℃、60℃，72℃延伸40 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳仪(DYCP-31BN，北京六一生物科技有限公司)检测结果。PCR产物送至安徽通用生物公司，应用Sanger测序法对TAP1-637和LMP7-145单核苷酸多态性位点进行基因分型检测。

2 结果

2.1研究对象基本情况 两组在年龄、种族、初产年龄、孕次和产次等方面差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 研究对象基本情况Tab.2 Basic dates of research object

2.2Hardy Weinberg平衡检验 经吻合度检验TAP1-637、LMP7-145两位点的基因型分布在各组均符合Hardy Weinberg平衡定律(感染组：P=0.245，对照组：P=0.351；感染组：P=0.817，对照组：P=0.792)，表示所选取的样本具有群体代表性，即所选取的样本能够代表河南省漯河市农村妇女的基因型分布。

2.3TAP1-637、LMP7-145多态性位点基因型 PCR扩增产物分别为405 bp、351 bp，其电泳图及多态位点测序结果见图1、2。

图1 TAP1-637、LMP7-145扩增产物电泳图Fig.1 Eelectrophoretogram of PCR products of locus TAP1-637 and LMP7-145Note:M.DNA Maker；Lane 1-8.The PCR products of locus TAP1-637 was 405 bp；Lane 9-16.The PCR products of locus LMP7-145 was 351 bp.

图2 TAP1-637、LMP7-145基因位点测序图Fig.2 Direct sequencing graph of locus TAP1-637 and LMP7-145Note:The arrow pointed to the polymorphism of locus rs TAP1-637 and LMP7-145.①.TAP1-637 genotype AA;②.TAP1-637 genotype AG;③.TAP1-637 genotype GG;④.LMP7-145 genotype GG;⑤.LMP7-145 genotype GT;⑥.LMP7-145 genotype TT.

2.4TAP1-637等位基因和基因型频率 TAP1-637位点的A、G等位基因的频率在对照组和感染组中分别为82.2%、17.8% 和82.1%、17.9%，两组间差异无统计学意义(P>0.05)；AA、AG、GG基因型频率分布在对照组(65.8%、32.9%和1.3%)和感染组(65.5%、33.3%和1.2%)间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 漯河市农村妇女TAP/LMP基因多态性分布情况Tab.3 Comparison of polymorphism distribution of locus TAP/LMP gene in in rural women in Luohe city

2.5LMP7-145等位基因和基因型频率 LMP7-145位点的G、T等位基因的频率在对照组和感染组中分别为82.7%、17.3% 和82.9%、17.1%，两组间差异无统计学意义(P>0.05)；GG、GT、TT基因型频率分布在对照组(67.5%、30.3%和2.2%)和感染组(68.2%、29.5%和2.3%)间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.6TAP1-637和LMP7-145位点单倍型分析 Haploview软件进行联合分析，结果显示存在连锁不平衡现象(D′=1.0，r2=0.5)，见图3。TAP1-637、LMP7-145的单倍型分析结果显示，对照组中单倍型GA频率为64.4%，GG为17.7%，TA为17.9%。与GA单倍型相比，GG、TA单倍型均与高危HPV感染风险无关(P>0.05)。见表4。

图3 TAP1-637、LMP7-145位点连锁不平衡分析Fig.3 Association between locus TAP1-637 gene and LMP7-145 detected by linkage disequilib-rium analysis

表4 TAP1-637、LMP7-145位点单倍型在对照组和感染组的比较Tab.4 Comparison of genotype of locus TAP1-637 and LMP7-145 gene in cervical high-risk HPV infection group and healthy control

3 讨论

高危HPV感染是宫颈癌及癌前病变的主要病因，且具有明显的区域性[7]，本研究选择漯河市农村妇女为研究对象，农村居住地人口相对稳定，少与外界通婚，流动性小，人群间生活方式及遗传背景较一致，能更好地突出地域性特点。另外，大量的研究表明机体是否发生HPV感染与环境、生活方式、免疫、遗传背景密切相关[8-10]，而目前免疫遗传因素是当今研究的热点[11]，因此本研究从免疫遗传学角度出发，探讨宫颈高危HPV感染的可能易感因素。

人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)即人类主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex,MHC)，作为机体的免疫遗传背景，在控制病毒的感染、肿瘤细胞的发生过程中起着重要的作用。在MHC-Ⅱ类区域内存在低分子量蛋白酶体(LMP)和抗原处理相关转运体(TAP)两类重要基因。LMP可将内源性抗原肽进行降解，产生合适的C-端氨基酸残基肽段，TAP可将肽段转运到内质网腔中，与HLAⅠ类分子结合，形成稳定的HLA-Ag复合物然后呈递到细胞表面被特异性细胞毒性T细胞(CTL)识别，产生特定的免疫应答反应。因而LMP和TAP被认为是调节自身免疫应答的关键因素。而LMP和TAP的多态性可使机体对内源性抗原肽有不同的识别力、亲和力和转运力，最终机体对内源性抗原肽免疫应答结果不同，免疫耐受、免疫保护或自身免疫。已有大量研究显示，LMP和TAP基因多态性和HBV感染、HCV感染有关[12-14]。但目前对LMP和TAP基因多态性与高危HPV感染研究报道较少。

基于以上思路，并考虑到基因多态性具有区域性特点，本研究在抗原呈递通路相关基因中选取了TAP1-637和LMP7-145两个多态性位点，首次对河南省漯河市农村妇女高危HPV感染人群及健康人群进行基因多态性检测，并进行易感性关联分析。基因多态性结果分析显示，TAP1-637和LMP7-145等位基因和基因型频率在高危HPV感染组和健康对照组间差异无统计学意义，说明TAP1-637和LMP7-145的基因多态性对个体是否会高危HPV感染可能无影响。为了进一步的探讨TAP1-637和LMP7-145基因多态性和高危HPV易感性的关系，本研究构建并分析了LMP/TAP单倍型，发现单倍体型在感染组和对照组间差异无统计学意义，进一步说明TAP1-637和LMP7-145的基因多态性可能和高危HPV易感性无关。

综上所述，我们首次研究发现TAP1-637和LMP7-145的基因多态性与河南省漯河市农村妇女高危HPV感染可能不具有相关性。这种结果,可能是由于本研究纳入病例数相对较少引起。 亦有可能是TAP1-637和LMP7-145对高危HPV感染的影响并非通过遗传因素或单核苷酸基因多态性产生,也不排除与TAP、LMP基因其他位点多态性有关等。因此，TAP1-637和LMP7-145位点与漯河地区农村妇女宫颈高危HPV感染之间是否有关联性，需要大样本、多中心研究研究，进一步确定。