核酸纯化装置研制与教学实践

李 欣, 赵玉红, 石建党, 衡 滨, 李小菊, 张伟英, 张金红, 赵立青

(南开大学 生命科学学院 生物实验教学中心, 天津 300071)

实验设备作为开展实验教学的载体,一直是高校实验室建设的重点内容[1-2]。当前,市售的仪器设备五花八门,通常具有外形美观、自动化程度高等优点,但在设计上往往因兼顾通用性而无法与教学实际紧密结合,难以满足专业基础教学的具体需求[3-4]。另外,外购设备一般价格较高,功能复杂,也因此而造成维修不便[5]。为此,各高校积极开展实验仪器设备自行设计和研制活动,这不仅是对实验教学硬件建设的有力补充,同时在更新实验教学手段,促进实验教学改革,提高实验教学质量和增强师生实践创新能力等方面都起到不可或缺的作用[6-7]。

我校一直以来都大力支持教师和实验技术人员自主研发制作实验教学仪器,并自2017年开始设立了自制实验教学仪器设备项目基金。我们充分结合实验教学实际和教学对象特点,自行设计制作了一款核酸纯化装置，并成功应用于实验教学,取得了良好的实践效果。

1 技术背景

分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学等多种学科相互渗透产生的学科[8],是以生物大分子(如蛋白质、核酸等)为研究对象的基础学科,其发展迅速,前沿性强,应用广泛,现已成为生命科学各个领域进行深入研究不可或缺的重要工具[9]。分子生物学又是一门实践性很强的学科,因此所涉及的实验技术众多,小量核酸纯化技术就是其中一种。

小量核酸的纯化是生物实验教学内容中经常涉及的实验技术,主要包括质粒DNA的小量提取、DNA琼脂糖凝胶中目的条带的回收、PCR或酶切产物纯化和细胞或组织总RNA的提取等。目前的纯化操作大多选用相应的商品化试剂盒进行,而其中最关键的步骤则是核酸在制备管(见图1)内吸附膜上的吸附结合和反复洗涤,通常采取多次离心的方法来实现。

图1 制备管结构

但在实验教学中使用离心法进行核酸的吸附与洗涤存在以下弊端：

(1) 离心后的液体盛接于制备管外部的套管中,这些废弃液体很可能因操作不慎从制备管下管口进入而造成管内吸附膜上核酸的污染；

(2) 离心机本身在使用上有着诸多要求,待离心的样品管需要严格配平并对称放置,而且离心法吸附和洗涤核酸通常需要较高的转速,如果学生操作不当则会威胁到仪器安全，甚至人身安全；

(3) 在受众面广的基础实验教学中,因离心耗时较长且离心机数量有限,往往会造成学生等待仪器和扎堆操作的现象。

除离心法以外,还可以将制备管的下管口接入真空歧管,再连接真空泵、缓冲瓶和泵管等,以实现对制备管内液体的抽出。但该装置并非一体化设备,使用麻烦,成本高,占用空间大,且真空歧管本身不易进行清洗和维护。另外,市售真空歧管大多具有数10个紧密排列的制备管插孔,在教学中多人使用时无法保证良好的气密性和足够的操作空间。因此,该装置并不适用于使用者众多的实验教学,无法满足教学工作中的实际需求。

2 装置结构

本装置的设计目的就是针对上述问题,提供一种能够代替离心法和真空歧管的一体化设备,用以提高小量核酸吸附和洗涤的操作效率。该装置的技术核心是选择具有较高泵头转速的蠕动泵,通过其转子交替挤压、释放泵管,在管内形成一定的负压进行抽液。主要技术路线是将蠕动泵进水端通过规格匹配的泵管与等径四通接头连接,四通接头剩余的3个接口分别通过泵管与等径三通接头连接,以最终实现将单管路分成6个管路。6个管路的泵管分别与6个三通阀(见图2)的引流口衔接。该三通阀具有2个接口,其中与引流口相对的接口作为制备管下管口的插口；另一个与引流口垂直的接口用于连接外接吸液管,2个接口的不同功能可通过三通阀开关进行切换。

图2 三通阀结构

外观上,该装置为一体化设备,蠕动泵、泵管、多通接头固定于仪器机箱内部,6个三通阀通过引流口垂直固定于机箱上表面,并且2个三通阀一组,二者连线靠近并平行于机箱上表面的某一边缘。制备管插口竖直向上,吸液管接口朝向机箱外侧并与该三通阀邻近的机箱上表面边缘垂直,使外接吸液管自然下垂,并通过机箱外侧壁上的固定卡扣收纳。机箱后面具有排水孔,用以将蠕动泵出水端通过泵管引出。机箱正面具有电源开关,后面具有电源接口。整个装置外观见图3。

图3 装置外观

3 装置功能

该装置提供了6个核酸制备管插口,通过蠕动泵从制备管下管口自动抽液,以实现在数10 s内快速完成小量核酸的吸附与洗涤操作,不仅能够大大提高核酸纯化过程的操作效率,而且制备管中的液体在蠕动泵的作用下即抽即排,废液不会污染制备管。每个插口分别由三通阀开关控制，以保证多个插口非同步抽液时管路中良好的气密性和不同制备管在操作时的相互独立性。另外,每个插口旁还连有外接吸液管,可通过三通阀开关与插口进行功能切换,便于仪器中管路的清洗,同时还可以用于不同实验中的常规“吸液—弃液”操作,有利于将该装置的应用范围进一步推广。

4 教学实践

4.1 服务内容与效果

该自制仪器设备主要是为提高实验教学中核酸纯化的操作效率而设计,现已面向本实验室承担的多门实验课程服务,主要包括分别面向本院大二和大三年级伯苓班、生物科学和生物技术专业开设的两门64学时基础必修课程——生物化学实验和分子生物学实验,所涉及的具体实验项目有“目的基因的纯化与回收”“载体pGEX-4T-2的制备”“目的基因/载体酶切片段的回收”以及“质粒DNA的提取和酶切鉴定”等。除基础实验外,该装置也应用于综合开放类实验教学,如在“实时定量PCR分析IPTG对启动子活性的调节作用”这一综合性实验中,需要采用试剂盒法提取大肠杆菌总RNA,该过程中涉及的多次RNA吸附和洗涤步骤就可以通过本装置轻松完成。另外,该仪器设备还可以实现自动“吸液—弃液”,这一常规操作功能可广泛应用于不同实验课程和教学内容当中。

通过近一年的教学实践,该实验装置受到了广大师生的高度认可与评价,将该自制仪器应用于实验教学中的反馈效果良好。

4.2 实践意义

相比离心法,该装置具有快速高效、操作简单、无污染及安全隐患等优点；相比真空歧管,该装置为一体化设备,无需组装,且体积小,成本低,易清洁。该装置能够大大提高学生纯化操作速度,且便于多人非同步操作,不仅可有效缓解学生因长时间等待和扎堆使用仪器而导致的课堂拥挤现象,还能避免因学生操作不当而造成的样品污染，甚至安全问题,提高实验教学效率和实验成功率,因而具有较高的实用价值。

自制仪器设备是由教师根据教学实际需要和学生学习特点而设计和制造,相比外购仪器,在实践教学中具有更强的创新性、实用性和针对性[11-12],更受学生欢迎。同时,在装置的设计与制作过程中通常需要涉猎多个领域,这就要求教师不断学习新技术新知识为自己充电,并把所学内容融会贯通,极大地锻炼了师资队伍的科学研究、教学研究和创新实践能力,提高了教师的综合业务水平[1,13],为进一步提升实验教学质量,促进实验教学改革与学科间的交叉融合奠定了良好的基础[14]。

5 结语

自制实验教学仪器大多是为解决或者填补现有设备某些功能的欠缺或不足,以便更好地贴合实验教学需求而自行设计或改进而成的[15]。在我校的大力支持和倡导下,生物实验教学中心生化与分子生物学实验室自主设计并制作了核酸纯化装置。该装置作为不同于真空歧管的一体化设备,不仅消除了以往教学实践中采用离心法纯化核酸所存在的问题和隐患,更具有操作简便、安全高效、小巧精致、易于维护等优点。目前,该装置已经成功应用于多门实验课程中,受到师生的一致好评。以该装置为代表的自制实验教学仪器不仅是对商品化设备的有力补充,对于进一步加快和促进实验教学改革,不断提高实验教学水平以及鼓励广大师生踊跃创新，更是起到积极的推动作用[16]。