昆虫性信息素提取与分析

马 涛, 林 娜, 刘小蓓, 张 娜, 张曼玉, 黄夏宁, 温秀军

(华南农业大学 林学与风景园林学院, 广东 广州 510642)

1 昆虫性信息素

昆虫性信息素由昆虫的特殊腺体分泌,能被同种异性个体所接受,并引起异性个体产生一定行为反应与生理反应(如觅偶、振翅、定向飞行、交配等)的微量化学信息物质(图1),是保证昆虫种内雌雄个体之间性的化学联系及有序繁衍的必要基础。许多昆虫具有以雌性信息素为主导的化学通信系统,像蛾类主要依靠雌性释放信息素引诱雄蛾完成交配,而雄性信息素主要是在雄性接近雌蛾时释放,诱导雌虫完成交配[1-2]。

对于昆虫性信息素的研究,长期没有突破性的进展,直到1959年Butenandt从50万头家蚕(Bombyxmori)雌蛾性信息素腺体中分离得到12 mg性信息素[3],才明确了第一个昆虫信息素的化学结构。由于昆虫本身释放信息素较少,且需要虫口数量较多,加上当时仪器设备条件与实验技术的限制,严重阻碍了昆虫性信息素研究的发展,而对于昆虫性信息素的研究,尤以提取获得性信息素组分和鉴定化学结构最为重要。因此,笔者根据自身经历以及前期科学家的研究,详细探索昆虫性信息素的提取方法和分析技术,旨在为昆虫性信息素的研究提供技术参考。

图1 昆虫释放性信息素的过程

2 昆虫性信息素的提取方法

昆虫通过腹部末端的特殊腺体组织释放性信息素,这一过程成为求偶行为,大多数昆虫的求偶姿态为腹部末端上翘(见图2),准确获得昆虫性信息素活性组分的时期为求偶时期。通过采用不同的萃取方法获得昆虫性信息素粗提物。

2.1 有机溶剂浸泡法

采用有机溶剂浸泡整个虫体(较小虫体)或虫体有性腺的部位,室温静置一段时间后吸取上清液,过滤处理并转移至另一洁净色谱瓶中,后用氮气将其浓缩到所需要的量再进行仪器分析。此方法对浸泡液的性质要求比较严格,溶剂的极性与提取性信息素的极性要相似,同时溶剂的纯度要高。通常会通过对溶剂进行二次重蒸处理,以确保性信息素能够全部溶解到溶剂中，并且将杂质含量降到最低。目前使用最多的是高效色谱纯正己烷,使用前将正己烷(HPLC)二次重蒸处理。此外,庚烷、二氯甲烷、丙酮、二甲苯等溶剂也是常用于提取昆虫性信息素[4-6]。

2.2 冷凝法

将净化的空气通入装有活虫的容器中,雌虫或雄虫分泌的性信息素随空气排出,在低温下冷凝收集。常用的冷凝材料有酒精-干冰和液态氮,该方法虽简单,但是昆虫信息素释放量较少,加上超低浓度的信息素在低温下不能产生雾滴,收集效果相对较差。有人用这个方法收集了12.2 mg的美洲蜚蠊性信息素[7]。

2.3 动态顶空吸附法

利用气固吸附原理,采取高效吸附剂将空气流中的性信息素分子吸附,随后再用溶剂洗脱。具体操作：将昆虫放入容器中,容器密闭,出口处连接吸附管,用真空泵抽走内部的空气,从入口处泵入经活性炭过滤的干净空气,带出容器内的挥发性成分,挥发性成分在出口处被吸附管吸附。一般活性炭前需连接加湿器,防止昆虫因缺水而死亡。将吸附管用合适的有机溶剂进行洗脱、浓缩。常见的吸附剂主要是Porapak Q(乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物),Super Q,Tenax(2, 6-二苯基对氧化次苯醚),XAD(二乙烯基苯/苯乙烯共聚物)。此方法的优点是能够采集活体昆虫的挥发物,并可对微量的化合物进行定性和定量的分析,测定结果能真实地反映被测昆虫所释放的化学组分及其比例,携带方便,适合野外操作；缺点是收集量少。对于像双翅目、同翅目等体型较小的昆虫性信息素的研究,这种方法的优越性非常明显[8]。

2.4 固相微萃取法

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)是一种新兴的提取昆虫性信息素的方法。其原理：用一根熔融的石英纤维,它的表层涂有特异性涂层,由于挥发物质的极性和官能团差异,需选择合适的纤维头,常见的纤维头主要有聚二甲硅烷(PDMS)、聚丙烯酸酯(Polyacrylate)、聚二甲硅烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、聚二甲硅烷/碳分子筛(PDMS/CMS)、二乙烯基苯/碳分子筛(DVB/CMS)；在提取过程中,纤维头被手柄推出保护针,将性信息素吸附在表面；然后将石英纤维直接注入气相色谱(GC)的进样口,吸附在其表面的挥发物在瞬时高温条件下解吸附,进入色谱柱分离。这种方法有如下优点：不需要溶剂,鉴定时无溶剂的干扰与污染；提取成本低,少量虫源即可达到理想的效果,样品分析快，操作简单方便。该方法也有明显的缺点：吸附剂纤维需在顶空气体中停留的时间要足够长,化学物质的挥发程度与时间长短成反比；化学物质的挥发性依分子大小、极性和官能团不同而异,须选择合适的吸附剂；温度影响吸附剂对挥发物的吸收；昆虫性信息素释放量甚微,且属于有活体的生物,所以SPME还受到纤维头是否在昆虫释放性信息素之前达到饱和状态有关；萃取后没有样品,仅仅只能做1次分析[9]。

3 昆虫性信息素的结构鉴定

现在，由于毛细管气相色谱(GC)、触角电位仪(EAG)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、气相色谱-触角电位联用(GC-EAD)、高压液相色谱(HPLC)等高效微量分析仪器的应用和分离提取技术的发展,进行昆虫性信息素化学结构鉴定所需的昆虫已从数十万头减少到几百头,几十头,而且缩短了研究周期,提高了工作效率。

应用EAG和GC-EAD分析方法对收集的性信息素进行分析测定,可以通过昆虫嗅觉感器对化合物进行识别,检测出活性成分；根据EAG反应和GC保留时间与Kovats指数测定结果,初步分析判定性信息素组分活性强度、含量及其比例；利用GC-EAD、GC-MS相结合,辅以微量化学反应方法,确定活性化合物结构,并以确定的活性化合物为标样(向试剂公司订购或项目组自己合成),以性信息素提取物为对照,进行GC-EAD和GC-MS分析,并辅以Kovats指数测定方法,进行性信息素成分鉴定(见图3)[10-12]。此外,可以采用GC-SCR(气相-单细胞记录仪联用)技术,通过记录雄触角上的单细胞化学感受器对候选化合物的电生理反应,测定出具有活性的化合物。

对于一些性信息素释放量较少的昆虫,可利用MEMS-GC-EAD(2017年12月刚报道的一种新型装置)筛选引起触角反应的活性化合物；同时可采用GC×GC/TOFMS(全二位气相色谱飞行时间质谱联用仪)测定其化学结构,它是20世纪90年代诞生的多维色谱分离技术,是把分离机制不同而又相互独立的两根色谱柱以串联方式连接在一起的二维系统,而飞行时间质谱(TOFMS)目前是唯一可以与GC×GC很好匹配的质谱技术,二者的灵敏度均可达到1pg[13-14]。

图3 昆虫性信息素组分的GC-EAD和GC-MS分析

在已鉴定出来的昆虫性信息素中,鳞翅目昆虫占大多数,这些性信息素在结构上往往具有双键结构,但GC-MS和GC×GC/TOFMS并不能确定性信息素组分的立体构型(不同构象的化合物可能具有相同的保留时间),质谱检测器仅能给出性信息素组分的大致结构,像分子量、官能团、双键个数等,但不能完全确定双键的位置、顺反异构[15]。因此,可利用微量化学反应及其他化学分析手段确定性信息素结构,例如单个双键的性信息素化合物,用DMDS(二甲基二硫醚)与化合物的CC发生衍生反应,然后将衍生产物经GC-MS分析,确定双键的位置。该方法的优点是顺式及反式不饱和化合物的DMDS衍生物质谱图虽相同,但保留时间不同,非极性色谱柱上的顺式结构化合物的衍生物的出峰时间早于反式化合物；共轭双键的性信息素化合物,可用MTAD(4-甲基-1,2,4-三哩啉-3,5-二酮)与化合物的共轭CC发生Diels-Alder加成反应,判断双键的位置,该方法生成的衍生物比较稳定,分子峰M+清晰,而且MTAD常温条件下与共轭二烯化合物的反应迅速,亲和力强。乙酸酯亲和力>醇类亲和力>醛类亲和力；以上方法都需要一定量的性信息素粗提物,而对于性信息素释放量甚微的昆虫而言,十分不便。

4 展望

目前,国内外对利用昆虫本身的生理特性及行为特点作为防控害虫的新型技术日益受到重视,其中以昆虫性信息素技术研究尤为突出。目前大多数昆虫的性信息素活性组分已经得到鉴定,进而大范围市场化,但是仍旧有一些重要昆虫性信息素研究没有任何进展,或者仅仅只有室内的电生理反应或者行为测试,这可能与昆虫虫体的发育状态、性信息素生物合成等因素有关。此外,部分昆虫的性信息素释放量更少,现有的分析仪器可能也无法检测到[16]。因此，需要在原有提取和分析性信息素组分的基础上,更加深入地探索昆虫性信息素的提取方法和分析鉴定技术,为更好地开展昆虫性信息素组分的研究提供技术参考。