干旱胁迫下NaCl对棉花幼苗抗氧化酶活性及水分特征的影响

冯春晓，郝志军，高健民，孙燕琳，柏新富

(1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025； 2. 烟台市出入境检验检疫局，山东 烟台 264000)

干旱是影响植物生长发育的主要环境胁迫因子之一。干旱条件下细胞中活性氧产生与清除之间的平衡失调，形成氧化胁迫[1-2]。植物经过长期进化形成了酶促和非酶促保护系统以清除活性氧，减轻或避免活性氧对细胞造成伤害[3-4]。氧化胁迫除能被干旱诱导外，还可被低温、盐渍、辐射、病毒、细菌等多种生物或非生物胁迫所诱导，是多种逆境的次级危害过程，抗性较强的品种一般都伴随较高的抗氧化酶活性[5-6]。事实上多数情况下植物需要同时面对多种逆境因素，此时的核心防线可能就是抗氧化系统，这也许是多数抗氧化物质非特异性的进化原因。已有实验表明，过表达SOD能提高植物对干旱、盐渍等非生物胁迫的适应性[7-8]，即抗氧化酶系统活性的增强可提高植物的综合抗性。

在干旱半干旱地区由于蒸发量远大于降水量，再加上植物根系的吸水作用，导致近地表土壤溶液浓缩、盐分浓度升高，植物根外盐浓度升高建立起的Na+电化学势梯度和植物细胞质膜内负外正的膜电势，有利于Na+从外界环境到植物细胞内的被动运输[9]，因此，干旱环境条件将诱使更多Na+被植物体吸收和积累。虽然Na+是造成植物盐分胁迫的主要成分，但也有实验证明Na+能促进植物的生长发育，有些植物更是把积累Na+作为适应干旱环境的有效策略之一[10-11]。本实验室的研究也已证明低浓度的NaCl处理可以增加干旱条件下棉花幼苗的生物量[12]。不过，有关干旱条件下土壤NaCl对植物抗氧化系统调节的研究还少见报道。本研究以棉花为材料，测定不同浓度NaCl处理下抗氧化酶活性、总抗氧化力及MDA含量随干旱程度的变化，探讨干旱条件下土壤NaCl对棉花耐旱性的调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

试验于2017年3-6月在温室内进行，供试材料为新农抗13号棉花(GossypiumhirsutumL.)。将种子播种于装有混合土壤(园土∶细沙=1∶1)的花盆中(花盆口径45 cm、高36.5 cm，每盆装混合土26 kg)，适时浇水，确保土壤湿润。混合土中的园土为棕壤土，前季作物为甘薯，土壤容重为0.95 g·cm-3，pH 7.2，电导率为0.78 ms·cm-1，有效氮、磷、钾含量分别为73.36、32.63和50.25 mg·kg-1。植株长出2片真叶时间苗，每盆留5株长势一致的幼苗。在苗龄40 d时将材料分成A、B、C、D、E五组(每组5盆)处理。处理时A、E两组浇水，B、C、D三组分别浇浓度为50、100、200 mmol·L-1的NaCl溶液，浇水或NaCl溶液的量为每盆12 L，确保盆土中溶液被替换为相应浓度的处理液。随后A、B、C、D组不再浇灌，进行自然干旱处理；E组每隔2 d浇水1 000 ml。最终形成的处理为：A，干旱+0 mmol·L-1NaCl(单一干旱) ；B，干旱+50 mmol·L-1NaCl；C，干旱+100 mmol·L-1NaCl；D,干旱+200 mmol·L-1NaCl；E,正常供水+0 mmol·L-1NaCl(对照)。在干旱处理期间每7 d取成熟度一致的叶片进行相关指标测定。

1.2 测定方法

1.2.1 酶活性测定 超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性测定参照孙群等[13]的方法；过氧化氢酶(CAT)活性测定采用郝建军等[14]的方法。酶活性以单位质量鲜组织引起的变化量表示。

1.2.2 总抗氧化力的测定 利用南京建成生物工程研究所的总抗氧化力试剂盒测定。按说明书进行操作，样品液0.1ml 分别加入试剂Ⅰ1.0 ml、试剂Ⅱ2.0 ml和试剂Ⅲ 0.5 ml，混匀，37℃水浴30 min(反应时间)，再加试剂Ⅳ 0.1 ml，混匀、放置10 min后520 nm测吸光度值(OD值)。以单位质量鲜组织反应每分钟OD值变化0.01为1个活力单位。

1.2.3 丙二醛(MDA)含量测定 采用赵世杰[15]的方法。

1.2.4 土壤、叶片相对含水量(RWC)测定 用烘干称重法，RWC(%)=[(鲜重-干重)/(饱和鲜重-干重)] ×100%。

1.2.5 植株水势、渗透势和细胞膨压的测定 植株水势用压力室法测定；叶片渗透势采用露点微伏压计(HR-33T, 美国)测定，叶片先在-18℃冰箱冷冻12 h以上，取出解冻至室温后挤压出组织液测定；细胞膨压由“水势-渗透势”计算得出。

1.2.6 叶片Na+含量测定 叶片Na+的提取参照王宝山等[16]的方法，提取液中Na+含量用原子吸收分光光度计(GBC-932B型，澳大利亚)测定。

1.3 数据处理

所有测定均重复5次，结果以“平均值±标准差”计。用Origin软件作图、SPSS 17.0统计软件进行数据处理和差异性分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理下棉花幼苗叶片SOD、POD和CAT活性变化

从图1可看出，对照植株叶片SOD活性相对稳定；干旱处理后的前21 d，各处理植株叶片SOD活性显著升高(前7 d升高较慢，可能与此时土壤和植株的水分含量较高有关)；21 d后处理A(单一干旱)植株叶片SOD活性急剧下降，处理B植株叶片SOD活性小幅下降，而处理C和D植株叶片SOD活性没有出现下降现象。POD活性随着干旱持续时间的延长，各处理(对照除外)均有逐渐增强的趋势(图1)。在干旱处理开始的前7d，处理B、C、D植株叶片POD活性略高于A、E。随后处理A植株叶片POD活性快速升高，且明显高于其它各组(图1)。各处理棉花叶片CAT活性随干旱处理时间的变化趋势与SOD类似，处理A植株叶片CAT活性先升后降，其它各处理的植株叶片CAT活性没有大幅变化。

注：A，干旱+0 mmol·L-1 NaCl；B，干旱+50 mmol·L-1 NaCl；C，干旱+100 mmol·L-1 NaCl；D，干旱+200 mmol·L-1 NaCl；E，不干旱+0 mmol·L-1 NaCl (对照)。下同。Note: A，Drought+0 mmol·L-1 NaCl; B，Drought+50 mmol·L-1 NaCl; C，Drought+100 mmol·L-1 NaCl; D，Drought+200 mmol·L-1 NaCl; E，Control. The same as below. 图1 不同处理棉花叶片SOD、POD和CAT活性随干旱持续时间的变化Fig.1 Variations of SOD, POD, and CAT activities in cotton leaves under different salt treatments with drought duration

2.2 不同处理下棉花幼苗叶片总抗氧化力的变化

图2 不同处理棉花叶片总抗氧化力随干旱持续时间的变化Fig.2 Variations in total antioxidative capacity in cotton leavesunder different salt treatments with drought duration

总抗氧化能力(T-AOC )是体内所有抗氧化酶和抗氧化物质抗氧化能力的总和，是衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标[17]。本试验结果显示(图2)，处理A(单一干旱)植株叶片总抗氧化力在干旱处理后的前7 d基本没有变化，随后迅速升高，至第21 d达到最高值，明显高于其它各处理，随后又快速下降。处理B、C、D的植株叶片总抗氧化力在干旱处理后的前7 d略高于A，随干旱持续时间延长逐渐升高，但变化速度明显低于处理A。处理E由于没有受到胁迫，总抗氧化力变化幅度较小。

2.3 不同处理下棉花幼苗叶片MDA含量的变化

MDA是脂质过氧化的产物，其含量表明植物体受活性氧破坏的程度，MDA积累越多，表明植物细胞受伤害程度越大[18-19]。图3显示，棉花叶片中MDA含量随干旱时间的延长均呈增加趋势，且处理A(单一干旱)的植株叶片MDA含量显著高于其它各处理，至干旱处理21d后其含量约为处理B、C、D植株叶片MDA含量的1.5倍。处理E(对照)没有明显变化。

2.4 各处理土壤和植株水分状况及组织Na+含量的比较

图4显示，土壤RWC除对照组因浇水而保持较高外，各处理均随干旱时间的延长而持续下降，但处理B、C、D的土壤RWC下降幅度明显小于处理A(单一干旱)；叶片RWC的变化只是在干旱处理的前7 d，因土壤水分较充足，各处理叶片RWC变化均较小，随后变化趋势与土壤相似。说明土壤盐分的存在既可增强土壤的保水能力，也有利于植株水分的保持。在外观形态上，干旱处理后第28 d，处理A棉花叶片出现严重萎蔫，而处理B仅轻度萎蔫、处理C和D没有出现明显萎蔫现象。对植株水分状况及组织Na+含量等的测定结果显示(表1)，干旱处理导致了植株水势和渗透势的极显著降低(P<0.01)；同样干旱条件下，随着土壤盐处理浓度的增加，植株水势和渗透势也显著降低(P<0.05), 也就是说干旱和土壤盐渍均可导致植株水势和渗透势的显著下降。然而，处理B、C、D植株虽然水势显著低于处理A(单一干旱)，但由于组织内积累了较多Na+，使叶片渗透势较处理A降低了17.5%～40.1%(组织渗透势与Na+含量的对数呈极显著负相关，y=-0.54ln(x)-1.84，相关系数r=0.996)，从而使其细胞膨压极显著高于处理A(P<0.01)。

图3 不同处理棉花叶片MDA含量随干旱处理时间的变化Fig.3 Variations of MDA content in cotton leaves underdifferent salt treatments with drought duration

3 讨 论

干旱等逆境胁迫下细胞内产生过剩的活性氧自由基，造成细胞膜系统损伤和透性增加，影响植物代谢[20]；同时，活性氧也可作为第二信使介导逆境胁迫下植物体内的信号转导，调节抗氧化酶等相关基因表达及酶活性的上升，从而提高植物的耐逆性[21-22]。SOD、POD和CAT是植物体内重要的抗氧化酶，已有大量研究证明植物的抗旱能力和受伤害程度与这3种酶的活性密切相关。李广敏等[23]对不同抗旱性玉米品种保护酶系统的研究表明，轻度、中度胁迫下SOD、CAT、POD活性随胁迫程度的增加而升高；重度胁迫下SOD、CAT活性降低，而POD活性继续增高。李国龙等[24]、杜彩艳等[25]、井瑾等[26]和Wang等[27]研究显示，随干旱胁迫强度增加多种植物的 SOD、POD、CAT活性均呈现先升高后降低的变化趋势。由此可见，SOD、POD、CAT活性随干旱胁迫强度的增大而升高，当胁迫强度超出植物能够承受的程度后，SOD、CAT活性出现降低，POD活性则因植物种类不同而表现出差异。本试验盆栽棉花幼苗用0、50、100、200 mmol·L-1NaCl溶液灌透后停止浇水，进行自然干旱处理。随干旱时间的延长，处理A(单一干旱)棉花叶片SOD、POD、CAT活性显著增加，在干旱处理后期，SOD和CAT活性又大幅度下降，这与已有的研究结果相似。而处理B、C、D (50、100、200 mmol·L-1NaCl溶液浇灌)棉花叶片SOD、POD、CAT活性变化幅度均明显小于处理A。另外，从外观形态上看，干旱处理后第28 d，处理A的棉花叶片表现出严重萎蔫，而处理B的仅轻度萎蔫，处理C和D的没有表现出明显萎蔫现象。可以认为，本试验中单一干旱处理的棉花幼苗在干旱期间SOD、POD、CAT活性的大幅升高和降低是干旱胁迫导致的严重细胞伤害的结果；而50～200 mmol·L-1NaCl溶液浇灌的棉花幼苗在干旱期间3种酶活性的升高和降低幅度较小，说明NaCl溶液浇灌土壤减弱了干旱胁迫对其的伤害程度。本试验中对总抗氧化力(T-AOC)和MDA含量的测定结果也证明了这一点。对各处理土壤和植株水分状况的分析发现，土壤加入适量盐分后显著提高了其保水能力，同时由于植株对Na+的吸收和积累，降低了叶片渗透势，从而维持了较强的吸水、保水能力和较高的细胞膨压，而细胞膨压的维持对正常生命活动的进行具有重要意义[28]。可见，土壤中适量盐分存在能够增加棉花对Na+的吸收和积累、降低组织渗透势、维持较强的吸水保水力，从而减弱因干旱脱水导致的过量活性氧自由基产生对植株的伤害，增强其耐旱性能。

图4 土壤和叶片相对含水量随干旱持续时间的变化Fig.4 Variations of RWC in soil and leaves under different salt treatments with drought duration

处理TreatmentNaCl/(mmol·L-1)叶片水势/MPaWater potential in leaves叶片渗透势/MPaOsmotic potential in leaves细胞膨压/MPaCell turgor叶片Na+含量/(mg·g-1)Na+ content in leaves A0-2.33±0.03 bB-2.17±0.04B-0.16±0.01eD1.90±0.21aAB50-2.52±0.02 cC-2.55±0.02C0.03±0.01dC3.64±0.26bBC100-2.67±0.027dC-2.84±0.01D0.17±0.02cB5.79±0.42cCD200-2.91±0.026eD-3.04±0.01E0.13±0.02bB9.56±0.39dDE0-1.41±0.035aA-1.75±0.01A0.34±0.03aA1.79±0.15aA

注：数据后字母相同表示无显著差异(P>0.05)，小写字母和大写字母不同分别表示在5%或1%水平上差异显著。

Note：The same letter within the same column indicates non-significant difference (P>0.05), the lowercase and capital letters indicate 5% and 1% level of significance, respectively.

植物对非生物胁迫的适应是一个复杂的过程，干旱和盐分组合条件下棉花适应干旱能力的增强，这其中有抗逆交叉适应的因素，但土壤盐分存在导致其离子积累的增加，有利于降低组织渗透势、增强吸水动力；积累离子参与渗透调节还可减少干旱条件下有机渗透调节物质合成所需的物质和能量消耗，这对植物的水分代谢和同化物积累可能是有益的。当然，根据已有研究结果，棉花萌发和生长的极限土壤含盐量约为0.4%～0.6%[29]，有关棉花盐胁迫研究设定的NaCl浓度多为100～200 mmol·L-1NaCl[30-31]，也有400 mmol·L-1NaCl[32]，本试验设定的最高200 mmol·L-1NaCl浓度，对棉花而言属于轻度到中度的盐胁迫，如果NaCl浓度过高再叠加上干旱无疑会对棉花造成伤害。有关棉花在利用盐离子作为渗透调节物质和避免盐渍化伤害之间如何平衡、以及不同植物在不同干旱程度下对其不会产生明显伤害且有益于其渗透调节的土壤盐分阈值是多少等问题还需进一步的试验研究。

4 结 论

1)与对照相比，单一干旱处理的棉花幼苗SOD、CAT活性和总抗氧化力在处理后的前21d大幅升高随后又快速下降，POD活性则持续升高，而干旱与50～200 mmol·L-1NaCl组合处理的棉花幼苗的抗氧化酶活性和总抗氧化力的变幅明显小于单一干旱处理的。

2)单一干旱处理的棉花幼苗叶片的MDA含量明显高于干旱与50～200 mmol·L-1NaCl组合处理的。

3)干旱与50～200 mmol·L-1NaCl组合处理的棉花幼苗的叶片相对含水量、细胞膨压和Na+含量显著高于单一干旱处理的，渗透势则显著低于后者。

4)上述结果说明，干旱条件下，轻度盐胁迫可以增加棉花植株对Na+的吸收和积累、降低渗透势，从而有利于维持水分平衡、缓解干旱胁迫对棉花幼苗的不利影响。