槟榔江水牛ACBP基因克隆及分子特征、组织表达谱分析

盛 丹，刘 琴，滕晓红，张永云，吉 丽，苗永旺

(1.云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 农科专业基础实验教学示范中心，云南 昆明 650201；3.云南农业职业技术学院 畜牧兽医学院，云南 昆明 650212)

在哺乳动物细胞内，酰基辅酶A结合蛋白(acyl-CoA binding proteins, ACBPs)编码基因组成一个多基因家族，该家族编码的蛋白质通常含有86～103个氨基酸残基，氨基酸序列保守[1]。ACBP又称为苯甲二氮卓结合抑制剂/地西泮结合抑制剂(Diazepam binding inhibitor, DBI)，最先在普通牛肝脏中发现，是一个大约10 ku受激素调节的蛋白质，由DBI/ACBP基因编码。该蛋白参与细胞内脂代谢和β-咔啉以及苯二氮卓的置换，调节发生在脑突触中A型γ-氨基丁酸受体介导的信号转导过程[2-3]。此外，ACBP除了在肾上腺中类固醇类促肾上腺皮质激素依赖性合成过程中起中介作用外，还介导胰腺分泌的反馈调节和餐后胆囊收缩素释放[4]。近年研究发现，ACBP的同源基因广泛存在于动物界、植物界、真菌界和原生生物界以及11个真细菌的物种中[5]。从酵母到哺乳动物ACBP都是保守的，其最保守的结构域由7个连续的氨基酸残基组成，构成了中长链酰基辅酶A酯的疏水结合位点[6-7]。在哺乳动物细胞中，ACBP蛋白以配体结合的方式定位于内质网和高尔基体中[8]。在酵母菌中，ACBP能增加细胞内酰基辅酶A的水平，并且在介导脂质合成和膜转运过程中具有重要作用[9]。在转基因大鼠肝脏和脂肪组织中，ACBP基因的过表达导致固醇调节元件结合蛋白-1(Sterol regulatory element-binding protein-1, SERBP-1)和过氧化物酶体增殖剂激活受体(Peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)减少，从而影响脂肪生成[10]。

迄今，相关ACBP基因的研究主要集中在人、鼠上，在其他动物上的研究报道较少。小鼠、大鼠和人类的ACBP基因均由4个外显子和3个内含子区域组成，它们的ACBP基因分别定位在1号、13号和2号染色体上[11]。通过查询NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，确定普通牛ACBP基因定位于2号染色体，包含4个外显子和3个内含子，其编码区序列全长264 bp，编码87个氨基酸。

水牛是热带、亚热带地区的重要家畜，具有许多珍贵的生物学特性。水牛乳的主要营养成分显著高于普通牛奶和人奶，是一种高档优质乳[12]。槟榔江水牛(Binglangjiang water buffalo, BLJ buffalo)是在云南西部发现的我国第1个本土河流型水牛类群，其泌乳量高，乳品质佳，有望培育成我国首个河流型乳用水牛新品种[13]。因此，以槟榔江水牛为研究对象，针对与乳脂代谢相关的基因开展研究，对该水牛的选育利用具有重要意义。目前，关于水牛ACBP基因的研究尚未见报道。

本研究以槟榔江水牛为研究材料，对水牛ACBP基因进行了分离鉴定及功能生物信息学和表达谱分析，旨在揭示水牛ACBP基因的理化特性和生物学功能，为深入研究水牛乳脂代谢的遗传基础提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

从云南省腾冲市采集饲养管理条件一致，年龄、胎次相近，无血缘关系，健康成熟的泌乳期与非泌乳期槟榔江水牛各5头，取乳腺、脑、心脏、肝脏、肌肉、肺、小肠、肾、皱胃、脾、胰腺、脂肪、脑垂体组织，迅速置液氮中，并转存于实验室-80 ℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1.2.1 组织总RNA提取与cDNA的合成 使用大连宝生物有限公司的RNA抽提试剂盒(RNAiso Plus, TaKaRa,中国大连)分离组织总RNA，用RNase-free水溶解产物后，经紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测其浓度及完整性。使用Oligo(dT)18(500 μg/mL)和反转录试剂盒(Invitrogen M-MLV, TaKaRa,中国大连)合成cDNA第1链。将反转录后的cDNA母液稀释为50 ng/μL的工作液，于4 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成 引物设计采用NCBI数据库中普通牛ACBP基因序列(NP_001106792)为参考序列，利用Primer 5.0软件设计用于扩增水牛ACBP基因完整编码区及用于该基因表达谱分析的引物，并以18S基因序列(JN412502)设计内参基因PCR引物，送昆明硕擎生物科技有限公司合成(表1)。

表1 引物信息Tab.1 The information of primers

1.2.3 PCR反应体系及条件 编码区扩增的PCR反应体系为25 μL，包含2×GC Buffer 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各0.5 μL，dNTP(2.5 mmol/mL)1.25 μL，ExTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL(购自大连TaKaRa)，模板cDNA 2.5 μL(50 ng/μL)，再加ddH2O 7.5 μL补足25 μL体系。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；然后95 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 30 s，34个循环；72 ℃后延伸5 min，于4 ℃终止反应。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测效果，将扩增效果好的PCR产物送到昆明硕擎生物科技有限公司进行双向测序。

1.2.4 数据分析

1.2.4.1 基因功能的生物信息学分析 采用DNAStar软件包对所测序列进行检查与核对，再采用ORF finder (http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)确定ACBP基因序列的阅读框，并进行同源比对分析，对获得的水牛序列进行基因鉴定。采用ProtParam tool、ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM 2.0 和ProtComp 9.0在线程序对该蛋白的基本理化特性、疏水结构域、信号肽、跨膜区和亚细胞定位进行预测分析。利用NCBI数据库Blast程序对蛋白保守结构域进行预测；利用NetPhos 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL在线软件或服务器进行蛋白质磷酸化位点、二级结构和三级结构的预测。此外，使用ClustalX、DNAman、MegAlign以及MEGA 5.0软件进行各物种间的同源性分析。

1.2.4.2 组织表达差异分析 采用半定量RT-PCR方法，以水牛18S基因作为内参对照，检测槟榔江水牛ACBP基因在乳腺、脑、心脏、肝脏、肌肉、肺、小肠、肾、皱胃、脾、胰腺、脂肪、脑垂体13个组织的表达量。PCR反应体系与操作程序同上。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用Quantity One软件对组织表达谱检测胶图分别进行分析，得出相对表达量数据。基于该数据，采用Excel软件构建基因表达谱柱状图。

2 结果与分析

2.1 水牛ACBP基因PCR扩增与鉴定

采用RT-PCR法对目的基因编码区进行扩增，得到421 bp的cDNA扩增片段(图1)，与预期扩增片段大小相符。通过测序获得目的片段序列。

M. DL2000分子量标准；1.水牛ACBP基因RT-PCR产物。M. DL2000 Marker; 1. RT-PCR product of buffalo ACBP gene.

利用ORF Finder软件对所测序列的开放阅读框进行识别，发现该序列的CDS区长264 bp，编码87个氨基酸(图2)。将所得到的CDS序列采用NCBI-Blast程序进行搜索对比，发现已公布的水牛基因中没有与本研究所获得的目的基因CDS区序列高度相似的基因，表明ACBP基因在水牛中尚未被克隆，但该基因序列与普通牛、绵羊、马、人和猪等物种ACBP基因有较高的同源性，故确定为水牛ACBP基因序列。将获得的水牛ACBP基因CDS区序列提交到NCBI数据库，获得序列号：KJ463745。经核酸组分分析，水牛ACBP基因CDS区序列的A、C、G、T碱基组成分别为37.50%，16.67%，25.38%，20.45%；G+C含量为42.05%。

2.2 水牛ACBP基本理化特征

槟榔江水牛ACBP的基本理化特征与普通牛(Bostaurus，NP_001106792)的ACBP一致性较高(表2)。槟榔江水牛ACBP理论等电点和相对分子质量分别为5.85,10.04 ku，其总的亲水性平均值(GRAVY)为-0.906；ACBP蛋白第80位氨基酸残基处有最大亲水值(-2)，在第25位氨基酸残基处有最小亲水值(0.333)；该蛋白不稳定系数为32.15。以上揭示水牛ACBP为亲水的稳定蛋白质。

ATG.起始密码子；*.终止密码子；阴影部分表示ACBP保守结构域。ATG.Start codon; *. Stop codon; The shaded area represents ACBP conserved domain.

表2 槟榔江水牛ACBP的基本理化特征Tab.2 Basic physicochemical characteristics of Binglangjiang buffalo ACBP

2.3 水牛ACBP的磷酸化位点

使用NetPhos 2.0在线软件预测槟榔江水牛ACBP的磷酸化位点，结果发现，该蛋白有4个磷酸化位点(表3)。

表3 槟榔江水牛ACBP磷酸化位点Tab.3 The phosphorylated sites of Binglangjiang buffalo ACBP

2.4 水牛ACBP的细胞定位与结构特征

亚细胞定位分析表明，槟榔江水牛ACBP定位于细胞质中发挥功能(可能性为96%)，该蛋白无跨膜结构、无信号肽，含有一个ACBP结构域，该结构域是ACBP超家族的成员特有的。

槟榔江水牛ACBP的二级结构主要由α-螺旋(Alpha helix)、β-转角(Beta turn)、延伸片段(Extended strand)和无规则卷曲(Random coli)组成(图3)，其中47个氨基酸组成α-螺旋、7个氨基酸组成β-转角、10个氨基酸组成延伸片段和23个氨基酸组成无规则卷曲，所占比例分别为54.02%，8.05%，11.49%和26.44%。水牛ACBP二级结构与普通牛的二级结构相似度较高(包含52.87%的α-螺旋、8.05%的β-转角、11.49%的延伸片段、27.59%的无规则卷曲)。根据同源建模方法预测的槟榔江水牛ACBP三维结构如图4所示。槟榔江水牛ACBP与普通牛ACBP模板(1hb8.1.A)的序列一致性高达98.84%。

预测的ACBP蛋白二级结构在其氨基酸序列下方用单个字母表示:h.α螺旋；e.延伸链；t.β-转角；c.无规则卷曲。The predicted ACBP protein secondary structure is shown in single letter below the amino acid sequence:h. Alpha helix; e. Extended strand; t. Beta turn; c. Random coil.

图4 槟榔江水牛ACBP三级结构Fig.4 Putative tertiary structural of Binglangjiang buffalo ACBP

2.5 ACBP氨基酸序列同源性及聚类分析

将槟榔江水牛ACBP氨基酸序列输入NCBI数据库进行Blast同源比对搜索，得到以下常见物种的同源序列：普通牛(NP_001106792)、牦牛(XP_005896385)、山羊(XP_005676309)、绵羊(XP_004004799)、马(XP_001487927)、人(NP_001073331)和猪(NP_999284)。水牛与上述物种的ACBP氨基酸序列一致性分别为98.9%，97.7%，97.7%，98.9%，90.8%，92.0%和92.0%(表4)。结果表明，水牛与其他牛科物种的ACBP氨基酸序列非常保守。在水牛与普通牛之间仅发现了1个氨基酸差异，即p.Q15H；而在水牛与牦牛之间却发现2个氨基酸差异，即p.Q15H和p.T18P。基于以上物种氨基酸序列，构建槟榔江水牛及其他7个物种间的NJ-系统树，以揭示各物种间的进化关系和物种间ACBP功能上的相似性。结果表明，水牛与牛科物种聚在一起，且具有较高的支持率(图5)。

表4 水牛与其他物种ACBP氨基酸序列的一致性Tab.4 Identity of ACBP amino acid sequence between buffalo and other species %

注：对角线上方数值表示序列一致性，对角线下方数值表示序列分歧度。

Note: Data above the diagonal line represent the percent identify and below the diagonal line represent the sequential divergence.

图5 ACBP氨基酸序列系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on the ACBP amino acid sequences

2.6 ACBP基因组织差异表达分析

采用半定量RT-PCR方法，以18SrRNA为内参，检测ACBP基因在成年槟榔江水牛13个组织中的表达差异。在非泌乳期成年水牛中，ACBP基因在瘤胃、心脏、脾脏中表达量较高；在肾脏、垂体、大脑、脂肪、皮肤和肌肉中表达量较低；在肝脏、肺脏、小肠和乳腺中几乎不表达。在泌乳阶段成年水牛中，该基因在心脏、瘤胃和大脑中表达量较高；在小肠、乳腺、垂体和脂肪中表达量适中；在肝脏、脾脏、肾脏、皮肤和肌肉中表达量较低；肺脏中几乎不表达(图6)。

3 讨论

本研究通过电子克隆的方法分离得到水牛ACBP基因的编码区全序列。通过同源比对分析确定为水牛ACBP基因的序列。槟榔江水牛该基因编码区序列长为264 bp，与普通牛ACBP基因编码区序列长度相同。该基因编码一个由87个氨基酸组成的多肽，其蛋白相对分子量为10.04 ku，理论等电点为5.85，与已研究的其他动物的ACBP相类似。生物信息学分析表明，水牛ACBP为亲水性蛋白，无跨膜结构，无信号肽，定位于细胞质中发挥作用；在结构上，水牛ACBP含有一个ACBP保守结构域，其二级结构与普通牛一致性较高；其三维结构与普通牛ACBP模板(1hb8.1.A)的序列一致性高达98.84%。经氨基酸序列比对发现，水牛与普通牛、绵羊的ACBP序列一致性为98.9%，水牛与山羊、牦牛的ACBP序列一致性为97.7%。物种间序列比对也表明，ACBP序列具有高度保守性，这与以往的报道相一致[6]，进一步揭示了该蛋白功能上的重要性。在构建的系统树上，水牛与普通牛、绵羊、山羊和牦牛聚在一起，表明水牛ACBP的功能与牛科物种较接近。以上进一步确认本研究所分离的基因为水牛ACBP基因，水牛该基因编码的蛋白质与普通牛及其他物种的ACBP的理化性质和结构特征一致性高，揭示水牛与其他物种ACBP的功能具有一致性。

18S rRNA表达作为内参；M.DL2000 DNA Marker；1.心脏；2.肝脏；3.脾脏；4.肺；5.肾；6.瘤胃；7.小肠；8.垂体；9.大脑；10.乳腺；11.脂肪；12.皮肤；13.肌肉。图中未标字母及标有相同字母的为差异不显著(P>0.05),标有不同字母者为差异显著或极显著(小写字母表示P<0.05,大写字母表示P<0.01)。

ACBP基因编码产物为酰基辅酶A结合蛋白，其通常以1∶1的化学计量高亲和性地结合饱和与不饱和的C14-C22酰基辅酶A脂[14]。长链酰基辅酶A酯是脂肪合成和脂肪酸降解过程中的重要中间体，同时，其在调节中间代谢和基因表达方面也有重要作用[1]。长链酰基辅酶A酯是一种两亲性分子，在较低的浓度下可以分化成磷脂双层结构，抑制大量的细胞功能和酶活性[1]。长链酰基辅酶A酯在发挥功能作用时需要维持一定量的酰基辅酶A与转运蛋白相结合，以便在需要酰基辅酶A时快速调用[1]。在真核细胞中起这种作用的主要蛋白因子就是ACBP[1]。因此，ACBP蛋白参与了许多细胞内的过程包括脂肪酸、甘油和甘油磷脂的生物合成、β-氧化、细胞分化和增殖以及众多的酶活性的调节，以及在细胞信号转导与脂质代谢途径中起着重要作用[15]。ACBP含有一个ACBP超家族的成员特有的高度保守的结构域，该结构域包含对酰基辅酶A高亲和力的功能位点[7]。近年研究显示，普通牛ACBP对长链酰基辅酶A酯表现出高亲和力，推测其在细胞内负责长链酰基辅酶A酯的运输和储存[16]；在泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中，ACBP在细胞内酰基辅酶A的运输过程中发挥特殊作用[17]；酵母ACBP的同源蛋白Acb1p是正常脂肪酸链的延伸、鞘脂的合成和囊泡运输等过程中所必需的，在细胞内脂质代谢中发挥特殊作用[18]；人的ACBP通过调节胆固醇生物合成起始步骤所必需的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase1, HMGCS1)和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGCR)而影响胆固醇的合成[19-20]；断奶期小鼠的肝脏中，ACBP的缺乏导致白色脂肪组织(White adipose tissue, WAT)脂解作用升高，肝脏脂肪堆积，以及SREBP(Sterol regulatory element binding protein)基因的延迟感应[21]。本研究结果显示，水牛的ACBP在氨基酸序列及结构上与哺乳动物一致性较高，所含的ACBP结构域在物种间是高度保守的。这表明水牛的ACBP在功能上与人、普通牛等极为相似，推测其可能参与细胞内脂质代谢、长链酰基辅酶A运输、胆固醇合成等过程。

在哺乳动物中，ACBP基因的表达量在不同细胞类型之间显著不同[14]。在哺乳动物细胞中，ACBP基因高表达于代谢活性高的组织中，比如肝脏、脂肪组织、皮肤、外分泌腺等[22]。在小鼠中，该基因在脂肪细胞及涉及运输功能的上皮细胞中表达量较高，而在肺、肌肉和脾脏等组织中的表达量较低[23]。在奶山羊乳腺组织中，ACBP基因的表达量在泌乳期显著高于非泌乳期[24]。本研究表明，在非泌乳期，水牛ACBP基因在心脏、脾脏、肾、瘤胃、垂体、大脑、脂肪、皮肤、肌肉中表达，其中瘤胃、心脏、脾脏中表达量较高；在泌乳期，该基因在心脏、肝脏、脾脏、肾、瘤胃、小肠、垂体、大脑、乳腺、脂肪、皮肤、肌肉中均表达，其高表达于瘤胃、大脑、心脏中。2个时期相比，ACBP基因的表达量在瘤胃、小肠、心脏、肝脏、垂体、大脑、乳腺、脂肪、皮肤、肌肉组织中差异较大，推测与该基因在这些组织的功能状态差异有关。此外，该基因在泌乳期乳腺、小肠、肝脏中表达，而在非泌乳期这些组织中不表达，表明该基因在泌乳期这些组织中发挥重要作用，推测该基因的表达可能与泌乳期乳脂代谢过程相关联。