家禽羽毛降解菌WYM39的分离鉴定及其产酶特性

文冰洁， 李晓霞， 柯 欣， 兰新慧， 贾良辉， 颜 华

(西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100)

随着现代社会家禽消费量的不断增加，家禽加工厂的副产品——羽毛也在快速积累[1]。羽毛占成熟家禽活体质量的5%～7%[2]。一般家禽羽毛会被倾倒，被填埋或焚烧，造成土壤、水和空气的巨大污染，羽毛的积累不仅导致环境污染，也是羽毛资源的浪费[3]。羽毛的主要成分是角蛋白[4]，角蛋白富含二硫键[5]和疏水侧链，使羽毛坚韧而耐化学腐蚀[6]。传统的降解羽毛的方法，如碱水解法和蒸汽高温高压水解法，不仅会破坏产物中的氨基酸[7]，同时消耗大量能量、造成成本高等问题[8]。由于环保意识的增强，生物降解羽毛的方法越来越受到人们的关注[9]。角蛋白不能被常见的蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等降解，但很容易被微生物产生的角蛋白酶水解[10]。细菌、放线菌、真菌等都可以产生角蛋白酶[11]，以丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶为主，在较宽的温度范围和pH值范围内具有活性[12]。角蛋白酶作为特殊的酶，不仅可以用于饲料和肥料产业，还可扩展到洗涤剂产业、皮革工业和医药行业[4]。此外，角蛋白酶能灭活朊病毒，在此方面有应用潜力[13]。为了丰富角蛋白降解的菌株资源，提供生长快速、产酶量高、具应用潜力的菌株，同时拓展角蛋白酶的获得来源，为发现更高效的角蛋白酶奠定基础，笔者采用以鸡羽毛为唯一碳氮源的分离培养基，对从1处鸡圈采集的土样，经初筛和复筛，选择降解效果最为突出的1株菌(编号为WYM39)，并对其进行16S rDNA分析及产酶条件和酶学特性的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品 2016年8月采集湖南省桑植竹林养鸡场羽毛堆积处地表5 cm的土壤，室内风干后储存于4 ℃。试验于2016年9月至2017年12月在西北农林科技大学生命科学学院放线菌分子生物学实验室进行。

1.1.2 培养基 羽毛粉培养基：羽毛粉10.0 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，琼脂20.0 g，蒸馏水 1 000 mL，121 ℃灭菌25 min；牛奶培养基：脱脂奶粉5.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL，115 ℃灭菌20 min；液体羽毛培养基：整根的羽毛10.0 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌25 min。

1.2 羽毛降解放线菌的分离

1.2.1 土壤样品的处理 称取(1.0±0.001) g土样置于 80 ℃ 干热消毒箱中处理2 h后，将其加入处理液[酵母膏 0.6 g，十二烷基硫酸钠(SDS)0.005 g，生理盐水10 mL，121 ℃ 灭菌25 min]，30 ℃，150 r/min培养30 min。

1.2.2 使用羽毛粉培养基进行分离及牛奶培养基初筛 将“1.2.1”节中的处理液稀释为10-2、10-3、10-4、10-54个梯度，取稀释后的处理液100 μL分别涂布于羽毛粉培养基平板上，每个梯度设3个重复。将样品于28 ℃倒置培养，每天观察1次，挑取单菌落于牛奶培养基上，通过观察有无水解圈进行初筛。

1.2.3 使用液体羽毛培养基进行复筛 将初筛的菌株进行传代、纯化，纯化后接种于具有整根羽毛的液体羽毛培养基，将具有显著降解作用的菌株保藏于50%甘油中。综合其生长情况，挑选1株生长快、降解效果好的菌株(编号为WYM39)进行后续试验。

1.3 羽毛降解菌WYM39的鉴定

1.3.1 菌株形态特征扫描电镜观察 挑取菌株WYM39的孢子在羽毛粉培养基上划线接种，在划线处斜插入经过无菌处理的盖玻片，28 ℃恒温倒置培养，培养数天后用扫描电镜观察。

1.3.2 菌株16S rDNA测定 使用Kirby Mix法[14]提取菌株WYM39的总DNA，使用通用引物F27/R1522(引物F27序列5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，引物R1522序列5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)扩增，回收PCR产物连接pMD-18T载体，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，选择阳性克隆，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。将菌株WYM39的16S rDNA序列在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，简称NCBI)网站中进行局部对比基本检索工具(basic local alignment search tool，简称BLAST)分析，通过Mega 5.0，以Neibour-Joining方法构建系统发育树。

1.3.3 菌株生理生化特征 菌株生长温度、最适pH值、NaCl耐受性、唯一碳源、唯一氮源、明胶液化、脲酶、淀粉水解、牛奶凝固与胨化、产H2S和纤维素分解试验参照文献[15]。

1.4 羽毛降解菌WYM39产酶条件研究

1.4.1 酶活的测定 本试验使用酪蛋白[casein(Sigma)]作为底物进行菌株WYM39粗酶液的酶活测定，参照文献[16]进行酶活测定和酪氨酸标准曲线测定。定义40 ℃下1 min每释放1 μg酪氨酸，升高1个酶活单位。

1.4.2 培养时间对菌株WYM39产酶的影响 将菌株WYM39接种于液体羽毛培养基中，于30 ℃、150 r/min条件下分别培养12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h，以菌液上清为粗酶液测定酶活。

1.4.3 培养温度对菌株WYM39产酶的影响 菌株WYM39接种于液体羽毛培养基中，培养温度分别为20、25、30、35、40 ℃，150 r/min条件下培养96 h，取粗酶液测定酶活。

1.4.4 初始pH值对菌株WYM39产酶的影响 将菌株WYM39接种于初始pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的液体羽毛培养基中，于30 ℃、150 r/min条件下培养96 h，取粗酶液测定酶活。

1.4.5 初始NaCl浓度对菌株WYM39产酶的影响 将菌株WYM39接种于初始pH值为7.0，初始NaCl浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70 mg/mL的液体羽毛培养基中，于 30 ℃、150 r/min条件下培养96 h，取粗酶液测定酶活。

1.5 对菌株WYM39酶学特性的初步研究

1.5.1 反应温度对酶活的影响 粗酶液与底物反应时，分别设置温度为30、40、50、60、70 ℃，测定并记录不同反应温度下的酶活。

1.5.2 反应pH值对酶活的影响 使用几种不同pH值的缓冲液配制pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的反应底物，与粗酶液混合后于最适温度下反应，测定并记录不同pH值对酶活的影响[16]。

1.5.3 WYM39粗酶液的温度稳定性 将粗酶液于30、40、50、60、70 ℃条件下处理30 min后，在最适温度及最适pH值条件下测定酶活。

1.5.4 金属离子对酶活的影响 在1 mL粗酶液中分别加入5、50、500、5 000 μmol的K+、Na+、Ca2+、Mg2+，混合后在 30 ℃ 放置30 min后测定酶活。

1.5.5 化学试剂对酶活的影响 在1 mL粗酶液中分别加入1 mmol苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mmol乙二胺四乙酸(EDTA)、10 μLβ-巯基乙醇、10 μg十二烷基硫酸钠(SDS)、10 μL 异丙醇、10 μg二硫苏糖醇(DTT)、10 μL二甲基亚砜(DMSO)，混合后在30 ℃放置30 min后测定蛋白酶活。

1.5.6 测定底物特异性 分别以可溶底物偶氮酪蛋白、酪蛋白；不可溶底物天青角蛋白、羽毛粉测定菌株WYM39粗酶液的酶活，不同底物的酶活测量方法参照文献[16]。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离筛选及菌株WYM39角蛋白降解效果观察

将采自鸡圈地表的土样处理后稀释浓度为10-4倍涂布于羽毛粉培养基平板上，挑取能在其上生长的单菌落接种在牛奶培养基平板上，将能够在牛奶培养基上产生明显降解圈的菌株传代、纯化，接种于整根羽毛配制的液体羽毛培养基中，选择1株具有生长快、降解效果好等特点的菌株进行后续研究，将其编号为WYM39。菌株WYM39在接种量为1%、30 ℃、150 r/min培养4 d时，能将100 mL液体羽毛培养基中的1 g完整羽毛完全降解(图1)。

2.2 菌株WYM39的形态特征

菌株WYM39在羽毛粉培养基上28 ℃恒温培养96 h，扫描电镜观察结果如图2所示，基丝无隔不断裂，直径0.3～0.6 μm；孢子短杆状，大小0.7～1.2 μm。在牛奶培养基上28 ℃恒温培养72 h，能观察到明显降解圈，菌落呈圆形，有白色孢子气丝，基丝黄褐色。

2.3 菌株WYM39的16S rDNA序列测定及系统发育树构建

提取菌株WYM39基因组DNA后，使用通用引物F27/R1522扩增得到菌株WYM39的16S rDNA，进行序列测定。菌株WYM39的16S rDNA序列大小为1 517 bp，将其在NCBI网站中进行BLAST分析，通过Mega 5.0，以Neibour-Joining方法构建系统发育树(图3)。该菌株与中间型链霉菌(Streptomycesintermedius)的相似度最高，为99%。

2.4 菌株WYM39的生理生化特征

菌株WYM39不仅能利用葡萄糖等多种碳源，还能利用亮氨酸、甲硫氨酸等氮源，但不能利用天冬氨酸、谷氨酸。菌株WYM39可在含有150 mg/mL NaCl的培养基中生长，且能分解明胶、淀粉，还能使牛奶胨化，但不能降解纤维素，也不能产生脲酶和H2S。其具体生理生化特征见表1。

2.5 菌株WYM39的产酶条件研究

2.5.1 培养时间对菌株WYM39产酶的影响 如图4所示，在培养时间为96 h时，酶活性出现峰值。发酵前期是菌体生长的时间，后期由于营养物质(羽毛)被耗尽，酶活性降低，因此96 h是研究菌株WYM39产酶条件合适的培养时长。

2.5.2 培养温度对菌株WYM39产酶的影响 如图5所示，在培养温度为30 ℃时酶活性最高，培养温度低于25 ℃或高于35 ℃时，酶活性很低，说明30 ℃是研究菌株WYM39产酶条件合适的培养温度。

表1 菌株WYM39的生理生化特征

注：“-”表示阴性；“+”表示阳性。

2.5.3 初始pH值对菌株WYM39产酶的影响 如图6所示，初始pH值在5.5～7.0时，酶活性在较高水平，在初始pH值为7.0时，酶活出现峰值，因此pH值为7.0是菌株WYM39产酶条件研究的合适初始pH值。

2.5.4 初始NaCl浓度对菌株WYM39产酶的影响 如图7所示，初始NaCl浓度为0时酶活性最高，随着初始NaCl浓度的升高，酶活逐渐降低，当NaCl浓度高于30 mg/mL后酶活降至极低水平，结合生理生化试验结果可知，菌株WYM39可在含有0～150 mg/mL NaCl的培养基中生长，但初始NaCl浓度为0是菌株WYM39产酶条件研究的合适初始NaCl浓度。

2.6 菌株WYM39粗酶液酶学特性研究

2.6.1 菌株WYM39粗酶液最佳反应温度和温度稳定性测定 如图8所示，该酶最适反应温度为60 ℃；温度稳定性测定试验结果如图9所示，该酶在60 ℃下30 min后仍保存89%的酶活性。

2.6.2 菌株WYM39粗酶液最佳反应pH值 如图10所示，粗酶液在反应pH值为8.0时酶活性最高，在pH值为7.5～9.0范围内能保持93%的酶活性。

2.6.3 化学试剂和金属离子对菌株WYM39粗酶液酶活的影响 如表2所示，和粗酶液的酶活性相比，PMSF、EDTA对粗酶液的酶活性具有抑制作用，而DTT、β-巯基乙醇、异丙醇、SDS、DMSO能够提高该酶的催化活性。

金属离子对菌株WYM39粗酶液影响试验结果如图11所示，K+、Na+、Ca2+、Mg2+在低浓度(5 μmol/mL)时对粗酶液的酶活性几乎没有影响，但在高浓度(5000μmol/mL)时对酶活有抑制作用，其中Ca2+的抑制作用最强。

表2 化学试剂对粗酶液酶活力的影响

2.6.4 菌株WYM39粗酶液的底物特异性 如表3所示，粗酶液可以降解可溶的偶氮酪蛋白、酪蛋白，也可降解不可溶的羽毛和天青角蛋白。

表3 不同底物对粗酶液酶活的影响

3 讨论与结论

在接种量为1%、30 ℃、150 r/min条件下培养时，菌株WYM39能在4 d将100 mL以整根羽毛为唯一碳氮源的培养基中的1 g羽毛完全降解，对鸡羽毛有较强的降解能力。结合形态观察、生理生化特征、16S rDNA基因序列分析、基于16S rDNA基因序列构建的进化树，初步确定菌株WYM39为链霉菌属(Streptomyces)的1个菌株。当反应体系中的Ca2+达到50 μmol/mL或PMSF为1 mmol/mL时，粗酶液的活性被抑制，表明该酶属于丝氨酸蛋白酶。菌株WYM39的粗酶液在反应温度为60 ℃时酶活最高，并在经60 ℃处理30 min后仍能保存89%的酶活，有在高温下应用的潜力。在底物特异性试验的补充试验中发现，反应体系添加10 μL/mL的β-巯基乙醇后，降解羽毛粉和天青角蛋白时酶活分别从4.97和 2.57 U/mL 提升到12.6和7.2 U/mL，分别提高了1.5和1.8倍，说明还原剂的存在对角蛋白降解有重要作用。此外，本试验仅采用以羽毛为唯一碳氮源的液体培养基为发酵培养基，培养基配方单一，有通过优化培养基配方提高产酶能力的潜力。