中型指环虫的体外培养方法的建立

郑瑞珠， 罗杨志， 张生元，， 喻运珍，， 张立强， 艾桃山，

(1.武汉中博水产生物技术有限公司，湖北武汉 430070； 2.武汉市农业科学技术研究院水产科学研究所，湖北武汉 430207)

指环虫是一类引发鱼类寄生虫疾病的重要病原[1]，指环虫种类繁多，主要寄生于鱼鳃部，对鱼的致病力有较大的种属差异性[2]。中型指环虫(Dactylogyrusintermedius)是寄生于鲫(Carassiusauratus)、鲤(Cyprinuscarpio)鳃部一种较常见的指环虫，国内外均有报道，该虫的寄生不仅会破坏鳃的完整性[3]、刺激黏液分泌亢进、引起鳃丝黏连及坏死，导致鱼类呼吸加速[4-6]，还能和其他种属的寄生虫共同侵染同一宿主的鱼并引起致病细菌和真菌的继发性感染，造成鱼类“烂腮病”临床症状，引起养殖鱼类大量死亡[2]。

指环虫的驱虫药主要有甲苯咪唑、吡喹酮、阿维菌素、辛硫磷等，由于这些药物长期大规模地使用，导致指环虫产生了不同程度的抗药性，新药研制已迫在眉睫。而目前，指环虫驱虫药物的筛选主要通过观察鱼鳃上指环虫数量的方法[7-12]，但因指环虫的感染、发育受环境影响较大[13]，且指环虫必须寄生在鱼鳃或幼鱼鳍条上[2]，离体无法长期存活，这些因素极大地限制了该方法的实用性，因此合适的指环虫体外培养模型对指环虫的研究及其防治技术研究具有重要的应用价值和意义。目前，还没有指环虫体外培养的研究报道，本试验将以金鱼(Carassiusauratus)鳃部的中型指环虫为研究对象，从培养液、抗生素及寄生载体3方面摸索中型指环虫体外培养条件，研究其在体外培养的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鱼 本试验金鱼均购自于湖北省武汉市武昌区八一路花鸟市场，养在武汉市农科院水产所山南鱼池，试验前均养在盛有24 h曝气的自来水中。

1.1.2 细胞 本试验所用鲤鱼上皮瘤细胞(epithelima popuasum cuprini，EPC)为华中农业大学水产学院赠予。

1.1.3 培养基和主要试剂 M199培养基(1×，withL-glutamine & 15 mmol/L HEPES)，购于HyClone公司；胎牛血清(FBS)和细胞胰酶消化液(1×，0.25% Trypsin-EDTA)，购于Gibco公司；其他化学试剂，均购于进口或国产分析纯。

细胞培养液：将M199细胞培养基与胎牛血清按9 ∶1(体积比)混匀，然后加入1‰抗生素氨苄青霉素和链霉素，青霉素工作浓度为100 U/mL，链霉素的工作浓度为100 μg/mL。

稀释液：无菌条件下，细胞培养液用灭菌的生理盐水(两栖类动物生理盐水为0.65%的NaCl溶液)稀释。

1.1.4 试验仪器 细胞培养皿、24孔板，均购于NEST公司；细胞培养瓶，购于NUNC公司；细胞培养箱，购于Thermo公司；解剖镜SMZ745T，购于Nikon公司，数码倒置显微镜Dsz2000x，购于重庆留辉科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EPC细胞培养 无菌条件下，将经传代培养的EPC细胞重悬于细胞培养液中，调整细胞密度为1.0×106个/mL，取1 mL接种于24孔板中，置于细胞培养箱中培养，温度25 ℃，通气5% CO2。待细胞贴壁形成单层细胞后，弃去细胞培养液，用生理盐水洗2遍，加入1.5 mL稀释液，备用。

1.2.2 中型指环虫的收集 用MS-222将金鱼麻醉后，超净工作台下用75%乙醇擦拭鱼体表面，取下鳃片用无菌水轻柔地漂洗2次，放在盛有少量无菌生理盐水的培养皿中，在解剖镜下将中型指环虫成虫从鱼鳃上剥离。

1.2.3 中型指环虫体外培养液摸索

1.2.3.1 细胞培养液对中型指环虫的影响 取25个从鱼鳃剥离的指环虫，分为5 组，每组5 个指环虫，置于等倍稀释(2倍)不含抗生素的稀释液中培养，温度为25 ℃，每隔24 h显微镜下观察1次。

1.2.3.2 抗生素对中型指环虫的影响 取55 个从鱼鳃剥离的指环虫，分为11 组，每组5 个指环虫，置于抗生素浓度逐步稀释的细胞培养液中培养，温度25 ℃，每隔24 h显微镜下观察1次，其中，抗生素的工作浓度为100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素为1×。

1.2.3.3 中型指环虫的培养液摸索 取55 个从鱼鳃剥离的指环虫，分为11组，每组5个指环虫，置于逐步稀释的稀释液中培养，温度为25 ℃，每隔24 h显微镜下观察1次。

1.2.4 中型指环虫与EPC细胞共培养 将“1.2.2”节中剥离的虫体转至“1.2.1”节中24孔板于细胞培养箱中共培养，温度25 ℃，每24 h于倒置显微镜下观察1次。

2 结果与分析

2.1 细胞培养液对中型指环虫的影响

由表1可知，细胞培养液(无抗生素)稀释后虽然可以延缓细菌繁殖速度，但最终还是无法控制，仍需添加抗生素；推测高浓度的细胞培养液可能不适合指环虫的生长。

表1 细胞培养液(无抗生素)对中型指环虫的影响

2.2 抗生素对中型指环虫的影响

由表2可知，未经生理盐水稀释的细胞培养液(无论是否添加抗生素)对中型指环虫的生存均有伤害；抗生素浓度在0.3×～1.0×时，均有较好的抑菌效果。

表2 抗生素浓度对指环虫的影响

2.3 中型指环虫的培养液摸索

由表3可知，体外培养条件适宜的为试验第6、7组，但考虑到高浓度抗生素和高浓度细胞培养液对中型指环虫的不利影响，故选择第6组为之后中型指环虫体外培养的培养液(细胞培养液与生理盐水体积比为5∶5，抗生素工作浓度为50 U/mL青霉素及50 μg/mL链霉素)。

表3 不同浓度稀释液对中型指环虫的影响

2.4 中型指环虫与EPC细胞共培养

“2.3”节中，与生理盐水相比，中型指环虫可以在稀释液中存活2 d，但仍时间不够长，推测中型指环虫离体培养的难点不仅是营养因素，还存在缺乏寄生载体的原因。

为了模拟鱼鳃表面，选择培养至形成单层细胞的鲤鱼上皮细胞(EPC)作为寄生载体，设计以下试验：取30 个从鱼鳃剥离的中型指环虫，分为6 组，包括4 个对照组和2 个试验组，每组5 个指环虫，25 ℃培养，每隔24 h于显微镜下观察中型指环虫的状态。由表4可知，比较对照组1、2，发现在没有EPC细胞作为寄生载体时，即便培养体系中添加培养液，5% CO2仍会造成指环虫的死亡；比较对照组3、4，发现在有或无5% CO2下，培养液可长期维持EPC细胞的形态不变；对比试验组1、2，发现中型指环虫可以黏附在EPC细胞上，EPC细胞可作为中型指环虫体外培养的寄生载体，并且在无5% CO2环境下的EPC细胞上附着存活更长时间。此外，图1为光镜下中型指环虫与EPC细胞体外共培养的形态观察图，80倍目镜下拍摄，图2为光镜下中型指环虫体外作尺蠖运动的形态观察截图，80倍目镜下拍摄，图2-A～图2-L分别为光镜下中型指环虫体外作尺蠖运动0～11 s时形态观察截图。

3 讨论

指环虫为卵生单性世代吸虫，结合前期研究者对单殖吸虫的生活史(除少数寄生在海水鱼体上的单殖吸虫具有中间宿主外，其他单殖吸虫生活史只有1个宿主)及食性研究(食物为上皮细胞、腺体分泌物、血液中的1种或几种)[14]，参考人类日本血吸虫的体外培养方法[15]，选择鲤鱼上皮瘤细胞作为寄生载体，符合上皮细胞特性，且该细胞培养温度与指环虫最适生存温度一致。M199培养基是培养鲤鱼上皮细胞的培养基，富含各种营养成分，并且试验过程发现，相同试验条件下，M199培养基的稀释液比RPMI1640培养基稀释液培养出的中型指环虫活力更强。本研究在体外模拟指环虫在鱼鳃上寄生形态，成功构建了中型指环虫体外培养的方法及模型，并能让中型指环虫成虫在体外存活6 d以上。

表4 EPC细胞对中型指环虫的影响

注：√表示在培养体系中含有该物质；×表示在培养体系中缺乏该物质。

本研究在体外中型指环虫与EPC细胞的共培养过程中发现，中型指环虫在无5% CO2环境下，寄生在EPC细胞上的存活时间更长，推测这与指环虫在鱼鳃表面寄生而非体内寄生有关，推测指环虫对氧气浓度有需求，与指环虫耐低氧性较差[16-17]一致。

中型指环虫和坏鳃指环虫是寄生在金鱼鱼鳃上的2种寄生虫，根据相同的方法在体外进行坏鳃指环虫与EPC细胞共培养，结果发现与中型指环虫相比，坏鳃指环虫较难附着在EPC细胞上，并且存活时间短于中型指环虫，推测可能与指环虫对宿主有较强的特异性有关[18]。

本研究在中型指环虫与EPC细胞的共培养过程中，观察到在EPC细胞上附着的中型指环虫虽然具有很好的活性，但很少或几乎不排卵，并保持成虫形态直至死亡，这种现象与人体血吸虫体外培养产卵数量少且均为不正常卵的结果[19]类似。现有研究结果表明，人工干扰或不利的环境条件通常会导致单殖吸虫虫体集中大量产卵[20]，并且离体条件下的产卵速率通常与在体条件下的不同[14]，推测本研究的体外培养方法虽为中型指环虫的生存提供比较好的营养条件及生存环境，但不能满足中型指环虫生殖的生理需求，因而中型指环虫产卵少或不产卵。

该方法的建立解决了指环虫必须寄生在鱼鳃或幼鱼鳍条上[2]，无法离体长期存活的问题。如果可以在体外培养指环虫1个世代周期，不仅有利于克服指环虫研究采样难的限制，还能缩短指环虫驱杀药物创制研究的周期。