不同中药提取物的免疫调节作用比较

杨海峰， 陈晓兰， 邱树磊， 武彩红， 奚兆寿

(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300)

近年来，在畜牧业中普遍存在着接种疫苗后仍然发生该病的流行，而鸡群处于免疫抑制状态是导致免疫失败的重要原因[1]。要解决这一问题，就必须采取有效手段，激活免疫系统，使畜禽机体接种疫苗后能够获得较高水平的系统免疫应答和黏膜免疫应答水平，增强机体的抗病能力。中药免疫增强剂因无公害、残留少、毒副作用小、药源广泛、便于应用的优点日益受到人们的关注[2]。

我国为世界上桑叶主要生产国之一，桑叶药材的资源尤为丰富，桑叶中营养丰富，含有人体必需的氨基酸、维生素、无机盐、黄酮、生物碱等多种成分[3]。现代药理证明桑叶具有多种药理活性，如降血脂、降血糖、降血压、抗衰老、抗肿瘤、抗菌等[4]，桑叶多糖具有增强机体免疫功能的作用[5]。杜仲属于杜仲科植物，为中国特有的植物物种，亦为世界宝贵的药源植物资源，具有延缓衰老、调血脂血压、抗菌、抗病毒、抑制肿瘤等药理作用[6]。同时研究显示，杜仲叶醇提取物[7]、杜仲叶浸提物[8]、杜仲叶多糖[9]、杜仲叶粉[10]均具有一定的增强免疫作用。

本研究以桑叶、杜仲、杜仲叶为原药材，制备桑叶水提物(MLAE)、桑叶粗多糖(MLCP)、杜仲水提物(EUAE)、杜仲叶水提物(EULAE)、杜仲叶粗多糖(EULCP)，研究不同中药提取物在不同给药剂量下对鸡新城疫疫苗血清抗体水平的影响，获得系统免疫效果最佳中药提取物及其给药剂量。在此基础上，研究最佳的中药提取物对免疫新城疫疫苗鸡呼吸道和肠道黏膜免疫功能的影响，综合评价开发为免疫增强剂的可能性。本研究对于充分利用现有的丰富天然资源，尽可能发挥天然药物的药用性能具有显著的研究价值，同时为筛选新型中药免疫增强剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

新城疫Ⅳ系苗(La Sota株)，购于青岛易邦生物工程有限公司，批号(140325001)；新城疫检测抗原，购于江苏省农业科学院兽医研究所；96孔微量血凝板，购于南通理能实验器材有限公司；隔水式电热恒温培养箱，购于上海跃进医疗器械厂；高速离心机：BIOFUGE PRIMO R，购于Thermo公司；电子天平，FA1104N型，购于上海精密科学仪器有限公司。IgA酶联免疫检测试剂盒，购于上海朗顿生物科技有限公司。

1.2 试验时间与地点

时间：2015年7—12月；地点：江苏农牧科技职业学院科技楼。

1.3 药物准备

桑叶，购于黄冈金贵中药产业发展有限公司，批号D5090101；盐杜仲，购于黄冈金贵中药产业发展有限公司，批号D5010301；杜仲叶，购于安徽亳州，批号20150314；芪黄素，购于艾迪森(北京)生物科技有限公司，批号1402253。

1.3.1 桑叶水提物 取桑叶药材500 g，加20倍量水，煎煮 2 h，4层纱布滤过，药渣同法煎煮和滤过，合并滤液。浓缩至500 mL，3 000 r/min离心10 min，去除沉淀，上液继续浓缩为浸膏，后60 ℃干燥即得。

1.3.2 桑叶粗多糖 取桑叶药材500 g，加20倍量水，煎煮 2 h，4层纱布滤过，药渣同法煎煮和滤过，合并滤液。浓缩至500 mL，3 000 r/min离心10 min，去除沉淀，上液加95%乙醇至含醇量为75%，静置24 h，弃上液，沉淀60 ℃干燥，即得桑叶粗多糖。

1.3.3 杜仲水提物 取杜仲药材500 g，加10倍量水，煎煮1.5 h，4层纱布滤过，药渣加等量水，再煎煮1 h，滤过，合并滤液，浓缩至500 mL，3 000 r/min离心10 min，去除沉淀，上液继续浓缩至浸膏，60 ℃干燥即得。

1.3.4 杜仲叶水提物 取杜仲叶药材500 g，加20倍量水，煎煮2 h，4层纱布滤过，药渣同法煎煮和滤过，合并滤液。浓缩至500 mL，3 000 r/min离心10 min，去除沉淀，上液继续浓缩为浸膏，后60 ℃干燥即得。

1.3.5 杜仲叶粗多糖 取杜仲叶药材500 g，加20倍量水，煎煮2 h，4层纱布滤过，药渣同法煎煮和滤过，合并滤液。浓缩至500 mL，3 000 r/min离心10 min，去除沉淀，上液加95%乙醇至含醇量为75%，静置24 h，弃上液，沉淀60 ℃干燥，即得杜仲叶粗多糖。

1.4 动物分组与处理

试验Ⅰ：1日龄非免疫健康雏鸡，饲养至14 日龄时，检测血清新城疫母源抗体效价，当低于4log2时正式试验。选择660羽随机均分为33组，每组20羽。分别为桑叶水提物、桑叶粗多糖、杜仲水提物、杜仲叶水提物、杜仲叶多糖大组及芪黄素药物对照组、免疫对照组和空白对照组，每大组设计2、4、8、12、16、24 mg(以总多糖含量计)6个剂量组。除空白对照组外，各组均采用NDV-IV疫苗滴鼻点眼免疫，1羽份/羽，28日龄进行二免。各给药组于每次免疫前3 d开始给药，连用7 d。给药剂量为2、4、8、12、16、24 mg/羽(以多糖含量计)相应中药提取物，均拌料给药。药物对照组芪黄素依据用药说明给药；免疫对照组(VC)和空白对照组(BC)不加任何药物。

试验Ⅱ：1日龄非免疫健康白羽蛋鸡，饲喂商品化饲料(购于泰州正大饲料有限公司)，自由饮水。雏鸡饲养至14日龄时，取240羽随机均分为6组，除空白对照组外均用NDV-IV系疫苗滴鼻点眼免疫，28日龄二免。在每次免疫的前3 d，桑叶粗多糖的高(MLCPH)、中(MLCPM)、低(MLCPL)剂量组每羽分别饮服MLCP 8、4、2 mg(以桑叶粗多糖计)，连用7 d；药物对照组芪黄素依据用药说明给药；免疫对照组(VC)和空白对照组(BC)不加任何药物。分别于首免后7、14、21、28 d，每组随机抽取6羽，测定气管和空肠洗液中sIgA含量。

1.5 指标检测

1.5.1 不同中药提取物对鸡ND血清抗体效价的影响 “试验Ⅰ”分别于首免后7、14、21、28 d，各组随机抽取10羽进行鸡翼静脉采血，采用血凝抑制试验检测血清新城疫抗体效价。

1.5.2 MLCP对鸡呼吸道和小肠黏膜免疫功能的影响 分别于首免后7、14、21、28 d，从桑叶粗多糖的高(MLCPH)、中(MLCPM)、低(MLCPL)剂量组及芪黄素对照组、免疫对照组(VC)和空白对照组(BC)随机抽取6羽鸡，用CO2安乐死，切取长约5 cm气管、空肠肠管，用止血钳夹住气管和肠管两端，注射器注入含0.1%牛血清白蛋白和蛋白酶抑制剂的冰浴PBS溶液0.5 mL，将溶液在肠管内充分挤压混匀3次后，收集所有肠洗液，4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，收集上清液，-70 ℃ 保存，采样全部完成后同时用酶联免疫吸附法(ELISA)测定洗液中sIgA的含量。

1.6 数据处理

数据以“平均值±标准误”表示，采用SPSS 18.0软件进行Duncan’s多重分析，比较各组血清ND抗体效价、气管和空肠sIgA的含量，采用Graphpad Prism 5软件绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 临床体征观察

试验期间至结束，各给药组鸡精神状态、采食、饮水均正常且生长良好。

2.2 血清抗体效价的变化

2.2.1 桑叶水提物对ND血清抗体水平的影响 首免后7～28 d，所有给药组和VC组新城疫血清抗体效价均显著高于空白对照组(P<0.05)。首免后7 d，8 mg剂量组抗体效价最高，显著高于16、24 mg组和VC组(P<0.05)，但与其他给药组比较差异不明显(P>0.05)；首免后14 d，12 mg剂量组抗体效价最高，显著高于除2、4 mg剂量组和芪黄素对照组外的其余各组(P<0.05)；首免后21 d，12 mg剂量组抗体效价依然最高，显著高于16 mg和VC组(P<0.05)，与其他给药组比较差异不明显(P>0.05)；首免后28 d，各给药组间无明显差异(P>0.05)(图1)。

2.2.2 桑叶粗多糖对ND血清抗体水平的影响 首免后7～28 d，所有给药组和VC组新城疫血清抗体效价均显著高于空白对照组(P<0.05)。首免后7 d，4 mg剂量组抗体效价最高，显著高于12 mg组和VC组(P<0.05)，但与其他给药组比较差异不明显(P>0.05)；首免后14 d，4 mg剂量组和芪黄素对照组抗体效价最高，与2 mg剂量组和免疫对照组差异显著(P<0.05)，但与其他给药组比较差异不明显(P>0.05)；首免后21 d，2 mg剂量组抗体效价依然最高，显著高于除 12 mg、芪黄素对照组外的其余各组(P<0.05)；首免后28 d，8、12 mg组抗体效价最高，显著高于除2、16 mg剂量组外的其余各组(P<0.05)(图2)。

2.2.3 杜仲水提物对ND血清抗体水平的影响 首免后7～28 d，所有给药组和VC组新城疫血清抗体效价均显著高于空白对照组(P<0.05)。首免后7 d，芪黄素对照组抗体效价最高，显著高于除4 mg剂量组外的其余各组(P<0.05)；首免后14 d，2 mg剂量组抗体效价最高，显著高于除24 mg剂量组和芪黄素对照组外的其余各组(P<0.05)；首免后21 d，12 mg 剂量组抗体效价最高，显著高于16 mg剂量组和免疫对照组(P<0.05)，与其他给药组间无显著性差异(P>0.05)；首免后28 d，2 mg剂量组抗体效价最高，显著高于除24 mg和芪黄素对照组外的其余各组(P<0.05)(图3)。

2.2.4 杜仲叶水提物对ND血清抗体水平的影响 在首免后7～28 d，所有给药组和VC组新城疫血清抗体效价均显著高于空白对照组(P<0.05)。首免后7 d，芪黄素对照组抗体效价最高，显著高于除4、8 mg剂量组外的其余各组(P<0.05)；首免后14 d，8 mg剂量组抗体效价最高，显著高于免疫对照组(P<0.05)，但各给药组间无显著性差异(P>0.05)；首免后21 d，4 mg剂量组和芪黄素对照组抗体效价最高，显著高于除2 mg剂量组外的其余各组(P<0.05)；首免后28 d，16、24 mg剂量组抗体效价最高，显著高于其余各组(P<0.05)(图4)。

2.2.5 杜仲叶粗多糖对ND血清抗体水平的影响 首免后 7～28 d，所有给药组和VC组新城疫血清抗体效价均显著高于空白对照组(P<0.05)。首免后7 d，各给药组与免疫对照组间无明显差异(P>0.05)；首免后14 d，各给药组显著高于免疫对照组(P<0.05)，但各给药组间无明显差异(P>0.05)；首免后21 d，芪黄素对照组抗体效价最高，显著高于除24 mg剂量组外的其余各组(P<0.05)；首免后28 d，各给药组与免疫对照组及给药组间均无明显差异(P>0.05)(图5)。

2.3 桑叶粗多糖对气管黏膜sIgA分泌的影响

由表1可知，7 d桑叶粗多糖各组气管洗液中sIgA浓度高于免疫对照、空白对照组，但差异不明显(P>0.05)。14、21 d桑叶粗多糖高、中剂量组气管洗液中sIgA浓度高于其余各组，与免疫对照组和空白对照组差异显著(P<0.05)。28 d 桑叶粗多糖高、中剂量组和芪黄素对照组气管洗液中sIgA浓度显著高于其余各组(P<0.05)。

2.4 桑叶粗多糖对空肠黏膜sIgA分泌的影响

由表2可知，7 d桑叶粗多糖各组空肠洗液中sIgA浓度显著高于芪黄素对照、免疫对照、空白对照组(P<0.05)。14 d 桑叶粗多糖中剂量组空肠洗液中sIgA浓度显著高于除高、低剂量组外的其余各组(P<0.05)。21 d桑叶粗多糖3个剂量组空肠洗液中sIgA浓度显著高于除芪黄素对照组外的其余各组(P<0.05)。28 d桑叶粗多糖各组和芪黄素对照组气管洗液中sIgA浓度显著高于免疫对照和空白对照组(P<0.05)，但桑叶粗多糖各组间无明显差异(P>0.05)。

表1 各组气管洗液中sIgA含量(n=6)

注：同列数据后不相同字母者差异显著(P<0.05)。下表同。

表2 各组空肠洗液中sIgA含量(n=6)

3 讨论

3.1 不同中药提取物对新城疫血清抗体水平的影响

动物机体的体液免疫应答是由B淋巴细胞介导的，通过对抗原的识别、活化、增殖，后分化为浆细胞并分泌抗体[11]。体液免疫应答是清除细胞外病原体最重要的途径[12]，因此血清特异性抗体水平的高低可作为评估机体体液免疫功能的重要指标之一[13]。

中药提取物由原材料或饮片应用科学的方法进行提取、分离、纯化制得，以更明确有效的成分、稳定可控的质量、治疗疾病的有效性等优势被广泛研究[14-15]。如黄芪多糖、淫羊藿多糖、峰胶黄酮、人参皂苷等中药成分可显著促进鸡外周血淋巴细胞转化，提高血清ND抗体效价[16]；中药九节茶可以改善应激负荷小鼠淋巴细胞数目及淋巴细胞亚群比例[17]。中药提取物对免疫细胞的刺激作用及对血清特异性抗体产生水平的影响常作为评价其是否具有免疫增强或免疫抑制作用的指标。

本研究比较桑叶、杜仲、杜仲叶不同提取物在不同给药剂量下对ND疫苗血清特异性抗体水平的影响。鸡在免疫ND疫苗前3 d，每日给以不同中药提取物(以总多糖计)，连用 7 d。结果显示，桑叶水提物组在首免后的7、14、21、28 d，12 mg 组抗体效价在大部分时间点优于其他各组；同法给药，桑叶粗多糖组在首免后的各时间点，4 mg组抗体效价优于其他各组；杜仲水提物组2 mg组抗体效价在多个时间点优于其他各组；杜仲叶水提物组4 mg组抗体效价在多个时间点优于其他各组；杜仲叶多糖组在不同给药剂量下，12 mg组稍优于其他各给药组，桑叶粗多糖在4 mg给药剂量下，在首免后7、21、28 d抗体效价均优于其他各组，在首免后14 d抗体效价与芪黄素对照组相似。因此，可以初步确定鸡每次免疫ND疫苗前3 d，以4 mg/羽给桑叶粗多糖(以总多糖计)，连用 7 d，可显著提高血清ND特异性抗体水平。

3.2 桑叶粗多糖对鸡呼吸道和肠道黏膜免疫水平的影响

呼吸道是空气进入机体的通道，时刻受到各种微生物及非己物质的刺激。呼吸道黏膜免疫系统是呼吸道抵抗外来病原体入侵的重要防线[18]。呼吸道组织中大量的免疫细胞均参与介导黏膜固有免疫应答和适应性免疫应答，合成和分泌大量的分泌型免疫球蛋白(如sIgA)和细胞因子，在抵抗病原体感染和黏膜疫苗免疫中发挥重要的调节作用[19]。

各组气管洗液中sIgA浓度随着时间的增加逐渐降低。在首免后14～28 d，桑叶粗多糖高、中剂量组气管洗液中sIgA的浓度均显著高于免疫对照和空白对照，稍优于桑叶粗多糖低剂量组和芪黄素对照组。表明鸡以8、4 mg/羽给桑叶粗多糖(以总多糖计)，可有效提高气管中IgA分泌量，提升呼吸道黏膜免疫水平。

肠道是机体最大的免疫器官[20]。肠黏膜产生的分泌型IgA(sIgA)，在黏膜表面提供了多种保护性功能[21]，能减少黏膜表面许多微生物的定居[22]，有效地中和病毒和肠腔中产生的细菌毒素[23]，并可选择地转移到其他黏膜组织中，从而为防止病原微生物入侵建立了广泛而稳固的黏膜屏障体系[24-25]。

本试验空肠洗液中sIgA含量的测定结果显示，各组空肠洗液中sIgA浓度也随着时间的增加逐渐降低。在免疫初期，桑叶粗多糖各组sIgA含量均显著高于芪黄素对照和VC、BC组。表明使用桑叶粗多糖在免疫初期能提高肠道sIgA水平，产生较好的免疫保护。在其他大部分时间点，桑叶粗多糖各组的sIgA含量均显著高于VC和BC组，稍优于芪黄素对照或与之相似，表明桑叶粗多糖能显著促进小肠sIgA的分泌，从而增强小肠的黏膜免疫功能。

综上所述，鸡每次免疫ND疫苗前3 d，以4 mg/羽给桑叶粗多糖(以总多糖计)，连用7 d，可显著提高血清ND特异性抗体水平，提高气管和小肠中sIgA分泌量，增强呼吸道和小肠的黏膜免疫功能。