血浆miRNA-135a及尿AD7c-NTP在轻度认知损害患者中的检测价值

胡轶虹 孙宏侠 白春艳 李宗树 刘敏 张明明 吕金珠 杨春丽

(吉林省人民医院神经内科，吉林 长春 130021)

阿尔茨海默病(AD)是一种慢性进行性神经变性疾病，目前尚无有效的治疗方法。因此，国内外专家一直致力于寻找症状早期的诊断性工具〔1〕，以利于早识别，早干预。本文在前期工作的基础上〔2〕，聚焦于轻度认知损害(MCI)阶段，检测患者的血浆miRNA-135a及尿AD7c-NTP水平，探讨其作为MCI早期诊断标志物的价值。

1 材料和方法

1.1实验分组 (1)正常对照(AMC)组，年龄≥60岁，保留正常的日常生活活动能力，无神经系统疾病，精神疾病及其他可导致认知功能损害的医疗情况。(2)MCI组，年龄≥60岁，用简易智力状态检查量表(MMSE)及临床痴呆评定量表(CDR) 进行认知功能临床评价。认知损害诊断标准：①21分≤MMSE≤28分；②非痴呆；③记忆力减退主诉；④保存一般认知功能；⑤较完整的日常生活活动能力(允许2个或更少的问题：电话、准备三餐，理财，完成家务)；⑥根据教育程度的校正：12年以下+1分，6年以下+2分。根据头电子计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)影像学检查及Hachinski缺血量表评分分为①血管源性(VD)-MCI组：Hachinski缺血量表评分≥7分伴有影像学脑血管病改变；②AD-MCI组：Hachinski缺血量表评分<4分且无影像学脑血管病改变。排除标准：①确诊痴呆；②中枢神经系统感染、头颅损伤、癫痫、多发性硬化、中毒代谢性疾病、帕金森病、颅内肿瘤、甲状腺功能减退；③抑郁症、精神分裂症；有酒精或药物依赖史；服用相关改善认知的药物；④合并严重心、肝、肾、脑及造血系统疾病。三组均行全面体格检查和神经系统检查，实验室检查(即血常规、尿常规、血生化、维生素B12和叶酸水平、甲状腺功能、同型半胱氨酸)和神经影像学(MRI或CT)检查。本研究所有受试者知情同意。筛选2016～2018年吉林省人民医院神经内科门诊及住院患者，根据入组标准，共筛选出80例，年龄60～94岁，其中AMC组28例，男13例，女15例，年龄中位数69岁；VD-MCI组28例，男19例，女9例，年龄中位数72岁；AD-MCI组24例，男13例，女11例，年龄中位数73岁。三组性别构成差异无统计学意义(P=0.199)，年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2血浆标本采集 空腹12 h后，用乙二胺四乙酸(EDTA)真空采血管采血，立即在1 380 r/min离心5 min。样本保存在4℃等待血浆制备，其后用1.5 ml EP管分装，储存在-80℃，直到进一步使用。

1.3尿液标本采集 受试者留取晨尿的中段尿，选取清亮的标本，经尿液分析测定，如有下列中任何一种异常即为不合格标本：①尿蛋白异常；②尿液中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)异常或有细菌生长；③尿中有结晶；④尿比重异常；⑤pH异常；⑥尿糖、酮体、硝酸盐、胆红素或尿胆原阳性。合格的标本进行离心(2 500 r/min，离心10 min)，过滤，取上清液置于-80℃冰箱密封保存备用。从取尿液到存入冰箱在2 h内完成。

1.4小RNA提取及miRNA-135a测定 应用miENeasy Mini Kit(Qiagen，德国)，逆转录试剂盒 (Qiagen，德国)，2×SYBR qPCR试剂盒(EZBioscience，上海)，按照说明书进行RT-qPCR，以cel-miR-39为外参，使用2-ΔΔCT法计算miRNA-135a水平。

1.5尿AD7c-NTP测定 应用AD7c-NTP试剂盒(朗顿，上海)通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶标仪450nm测定吸光度，计算样品浓度。

1.6统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t、χ2检验、方差分析。miRNA-135a及AD7c-NTP水平与MMSE评分相关性用Pearson相关系数分析。

2 结 果

2.1各组血浆miRNA-135a水平比较 AMC组血浆miRNA-135a水平为(9.87×10-7±5.66×10-7)，VD-MCI组血浆miRNA-135a水平为(4.17×10-7±8.35×10-8)，AD-MCI组血浆miRNA-135a水平为(2.83×10-7±1.72×10-7)，三组miRNA-135a水平差异有统计学意义(F=30.76，P=0.00)。

2.2各组尿AD7c-NTP水平比较 AMC组尿AD7c-NTP水平为(285.83±89.12)ng/L，VD-MCI组尿AD7c-NTP水平为(353.02±96.96)ng/L，AD-MCI组尿AD7c-NTP水平(418.57±112.32)ng/L，三组尿AD7c-NTP水平差异有统计学意义(F=9.96，P=0.00)。

2.3MMSE评分与miRNA-135a水平相关性 对VD-MCI组MMSE评分与血浆miRNA-135a水平进行Pearson相关性分析，结果显示二者间无明显相关性(r=0.20，P=0.31)。对AD-MCI组MMSE评分与血浆miRNA-135a水平进行Pearson相关性分析，结果显示二者间无明显相关性(r=0.24，P=0.25)。

2.4MMSE评分与尿AD7c-NTP水平相关性 通过Pearson相关性分析，VD-MCI组MMSE评分与尿AD7c-NTP水平无明显相关性(r=0.18，P=0.46)。AD-MCI组MMSE评分与尿AD7c-NTP水平无显著相关性(r=-0.31，P=0.14)。

3 讨 论

目前用于AD诊断的特异性生物学指标有脑脊液中β淀粉样蛋白1～42，总tau蛋白，磷酸化tau181P蛋白〔3，4〕。然而，CSF的侵袭性收集过程限制了这些检测方法的日常临床使用。miRNA是一类非编码小分子RNA，通过调控转录后基因表达发挥其生物学功能。近年来研究发现，miRNA在大脑发育、神经元分化、突触联系和树突棘形成等过程中发挥重要作用〔5〕。miRNA 能够分泌至血浆或脑脊液等外周体液〔6〕，而且 miRNA 经囊泡运输或与高密度脂蛋白紧密结合，可以在外周体液中稳定存在〔7〕；同时，外周体液中的miRNA 水平随大脑中 miRNA 水平变化而变化，且变化幅度也十分相近。因此，通过外周血液检测miRNA可能辅助AD诊断。Liu等〔8〕研究发现，APP/PS1双转基因AD小鼠模型海马组织中miRNA-135a较野生型小鼠显著下调，且AD小鼠模型CSF和血清中的miRNA-135a亦显著下调。由于miRNA-135a相对BACE1和Aβ42而言处于生物级联作用的上游，故miRNA-135a可能对于AD的早期诊断有潜在帮助。这个猜想也在与Aβ42阳性率的横向比较中得以印证-外周血miRNA-135a可能是较Aβ42更适宜的AD诊断〔9〕，特别是早期诊断的标志物。本研究发现miRNA-135a在轻度认知损害患者中降低，在AD源性MCI中降低更为明显，证明miRNA-135a可作为AD源性MCI早期筛选诊断标志物。

AD7c-NTP由De La Monte等〔10〕于1997年首次在晚期AD患者的颞叶脑组织中用抗胰腺丝蛋白抗体分离并命名，是一种分子量为41 kD的跨膜磷蛋白，主要在神经元中表达，定位于神经细胞的轴突，并且在AD患者脑内选择性增高〔11〕。研究表明，增高的AD7c-NTP可从早期的AD 患者脑脊液及尿样本中检测到，而且脑脊液及尿液中AD7c-NTP水平与痴呆的严重程度相关〔12〕。 AD源性MCI作为AD的早期有症状阶段，其脑中发生的病理变化与AD相似，陈英道等〔13〕研究发现AD7c-NTP在AD源性MCI患者的脑脊液及尿液中含量均升高，且诊断的灵敏度及特异度较高。本研究发现AD7c-NTP在所有MCI的患者中均有升高，但AD源性MCI组升高更为明显，说明AD7c-NTP可作为AD源性MCI筛选诊断标志物。而将血浆miRNA-135a与尿AD7c-NTP相结合，可进一步提高诊断的准确性。