LncRNA在自身免疫性疾病中的研究进展①

夏芳芳 胡明智 孙慧莹 庞春艳 杨国安

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院风湿免疫科，包头 014010)

1 LncRNA概述

1.1LncRNA的结构与作用 LncRNA是一种非编码RNA，由大于200个核苷酸组成。它存在于细胞核或细胞质中[1]，由于缺少有效开放阅读框，LncRNA很少编码或不能编码蛋白[2]。2016NONCODE数据库中显示人体中有超过90 000个LncRNA基因，他们被称为基因组的转录噪声，目前研究表明LncRNA可在表观遗传水平、转录水平(染色质重塑和DNA甲基化)、转录后水平(mRNA剪接)、蛋白修饰过程等方面借助复杂的关系网络对基因表达发挥调控作用[3]。LncRNA通过长链本身的不同区域与特异的蛋白质、DNA、RNA相结合而发挥作用，进一步提示LncRNA具有更广泛与复杂的调节手段[4]。LncRNA参与多种疾病的病理过程[5，6]，将其应用于疾病的诊断和预后比编码基因更有优势，如Collins等[7]研究LncRNA在肝癌中的生物学机制，发现LncRNA是诊断肝癌关键性生物标记物之一及治疗的新靶点。LncRNA可以调节微小核糖核酸(MicroRNAs)，也能调节mRNA的表达[8]。

1.2LncRNA来源及分类 LncRNA主要由聚合酶II转录形成，其他的形成途径有:①蛋白编码的基因结构断裂而形成；②来源于染色质重组，在2个未转录的DNA区域结合，生成含有多个外显子的LncRNA；③通过转座子，在非编码基因复制过程中移位而产生；④有的也来源于局部串联的复制子。尽管所有LncRNA的起源没有共同的机制，但LncRNA在调节基因表达上具有相似的作用。LncRNA的分类可按照其在染色体上与蛋白质编码基因的相对位置分为基因间LncRNA(intergenic LncRNA，lincRNA)、双向 LncRNA(divergent LncRNA)、正义LncRNA(sense LncRNA)、反义LncRNA(antisense LncRNA)、内含子LncRNA(intronic LncRNA)及外显子 LncRNA(exonic LncRNA)[9]。

2 LncRNA与免疫炎性反应

2.1LncRNA 参与基因的表观遗传修饰 表观遗传修饰是在不改变基因序列的情况下，通过对基因的修饰来调控基因的表达。目前已知的表观遗传现象包括DNA甲基化(DNA methylation)、基因组印记(Genomic impriting)、母体效应(Maternal effects)、基因沉默(Gene silencing)和核仁显性等。LncRNA可以以 RNA 的形式从多个层面调控免疫基因的表达。HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)在组蛋白修饰中形成至少两种组蛋白修饰复合物[10,11]。LncRNA已被证明参与CpG岛的甲基化过程。由于DNA甲基化被认为与细胞增殖密切相关[12]，故LncRNA被认为在人类癌症和自身免疫性疾病等疾病的表观遗传学调控中发挥重要作用[13]。多项研究表明LncRNA在X染色体失活、基因印迹和基因沉默中起到了重要的作用[14]。

2.2LncRNA在炎症激活中的作用 天然免疫系统包括树突状细胞(Dendritic cell，DC)和单核/巨噬细胞(Monocyte/giant eosinophilic cells)，通过模式识别受体来认识病原体并启动免疫应答。在病原体应答路径中，LncRNA的表达模式和功能是高度特异的[15]。Susan等[16]发现LncRNA-COX2在细胞初级免疫应答中发挥重要作用，它是巨噬细胞在Toll 样受体 (Toll-like receptors，TLR)连接反应上高度诱导表达的LncRNA之一，介导了天然免疫细胞中不同类别的免疫基因的激活和抑制。调控LncRNA-COX2的基因是通过炎症因子(TLR1、IL-6和IL-23a)、趋化因子5(CC chemokine ligand 5，CCL5)和趋化因子CX3CL1(Chemokine CX3CL1，CX3CL1)。当机体存在炎症时，LncRNA-COX2会激活多个调控炎症的基因，而无炎症时则会抑制这些基因的激活。孙慧杰等[17]发现结核杆菌感染的小鼠巨噬细胞中肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达明显增高，而敲除LncRNA-COX2后TNF-α又显著下降，进一步说明LncRNA-COX2是调节结核杆菌感染后炎症因子释放的关键信号分子。王俊钢等[18]发现长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1(Long-chain non-coding RNA lung adenocarci-noma metastasis-associated transcript 1，LncRNA MALAT1 )可以调控 miR-205的表达而影响非小细胞肺癌细胞A549 的侵袭和迁移能力，为探索非小细胞肺癌发生的分子机制和新的治疗策略提供相应理论帮助，将来有望成为治疗非小细胞肺癌的新靶点。

3 LncRNA对免疫细胞的作用

目前研究发现LncRNA在固有免疫及获得性免疫细胞的发育和分化过程中具有重要的作用。作用于固有免疫的细胞包括DC和单核/巨噬细胞。Wang等[19]通过对LncRNA在DC分化和功能中作用的研究，发现了高表达于DC的特异性LncRNA，命名为Lnc-DC，从而调控DC的分化，阻止它们在目标基因上的积累，抑制过度的炎性反应。当DC缺失了Lnc-DC则无法有效地启动CD4+T细胞在病原体刺激后分泌炎症因子。Lv 等[20]在研究肾脏炎症时发现了巨噬细胞的特异性LncRNA 分子LncRNA7949在单侧输尿管梗阻小鼠模型中表达显著上调，在小鼠巨噬细胞株 RAW264.7 及骨髓衍生的巨噬细胞中也存在表达，并受到 TLR4/NF-κB信号通路的正向调节，可促进单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)的转录并诱发巨噬细胞依赖的肾脏炎症产生。CD4+T细胞分化为辅助性T细胞，对于获得性免疫应答是非常关键的，许多研究表明LncRNA可能是决定这个过程的关键分子。目前已发现存在多种Th细胞特异性的LncRNA并给予进一步研究 。Th细胞包括Th1、Th2和Th17，控制这些细胞的关键转录因子分别为转录因子T-box基因家族新型的转录因子(T-bet)、GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3，GATA3)、维甲酸孤儿核受体γ亚型(Retinoid-related orphan receptor gammat，ROR-γt)和碱性亮氨酸拉链转录因子(Basic leucinezipper transcription factor，BATF)[21]，其中研究较充分的有Th1和Th2细胞。Th1细胞通过T-bet依赖性机制特异性表达LncRNA Tmevpg1(Eilefs murine encephalomyelitis virus persistence candidate gene 1)，它是位于干扰素γ基因区域下游的非编码RNA，在阻止病毒清除方面发挥重要调控作用。而LncRNA Tmevpg1又可以调控人Th1细胞特异转录因子信号传导及转录激活因子4(Signal transducer and activator of transcription 4，STAT4)和T-bet的活性[22]。其中T-bet不但可以结合Tmevpg1基因的启动子，而且也能作为Th1细胞上游远端的增强剂。Zhang等[23]发现Th2 特征性长链非编码RNA GATA 结合蛋白3 反义RNA1(Long non-coding RNA GATA3 antisense RNA 1，LncRNA-GATA3-AS1)和GATA3都在小鼠和人Th2细胞中表达。该研究通过对季节性过敏性鼻炎(Th2相关疾病)患者进行过敏原刺激后检测了患者的CD4+T细胞，从中观察到GATA3-AS1的增加，进而说明LncRNA-GATA3-AS1可能会作为Th2应答的特定指标。根据上述Th细胞的研究表明，LncRNA通常与转录因子协同后对细胞进行调节。

4 程控特异性LncRNA

LncRNA的表达是高度程控特异性的，这似乎在整个进化中都守恒。研究表明，LncRNA的表达模式可以预测它们的组织特异性功能。如皮肤特异性的LncRNA HOTAIR在皮肤成纤维细胞中表达，它控制了编码基因HOX的表达，进而识别皮肤上某种细胞的位置[24]。另外组织分化诱导非蛋白编码RNA(Tissue differentiation inducing non-protein cod-ing RNA,TIN-CR)可以上调角化细胞的分化，同时也是表皮中形成与屏障相关的诱导基因编码产物所需的[25]。LncRNA通过在胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)中的特异性表达与染色质调节因子发生作用来维持ESCs的多能性并抑制其向终末细胞谱系分化。通过对ESCs中LncRNA表达和功能的分析，已经确定在ESCs中明确表达的226个 LncRNA[26]。通过用短发夹RNA对每个LncRNA进行系统地敲除，研究提示大约90%在ESCs转录的基因，其表达产生有意义的作用。LncRNA的特异性被保留在转录的各个阶段，包括增强子RNA(enhancer RNAs，eRNAs)和circRNA(环形RNA)在免疫细胞中也遵从这样的原则。。

5 LncRNA在自身免疫性疾病的治疗和疾病风险方面的研究

LncRNA与针对人体自身正常组织产生的异常反应而导致的自身免疫病相关，且与多种复杂蛋白编码基因和非蛋白编码基因相关。而LncRNA又是白细胞的转录增强剂，可以通过基因和环境因素来改变增强子功能。当使用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)聚合酶链式反应敲减单个LncRNA转录激活物后发现LncRNA的转录使周围其他特定基因的表达增强。LncRNA通过与被调节基因的启动子接触，与转录激活物共同作用于基因座的敏感位点，最终可导致自身免疫病。全基因组关联研究同样认为大量的基因突变(单核苷酸多态性)增加了自身免疫性疾病的风险，也影响了病因方面的研究。而且这些突变的基因可能会通过调节新发现的RNAs顺式作用元件或反式作用因子影响编码蛋白的基因表达，进而改变细胞的表型来增加疾病的风险[27]。此外，LncRNA在防止疾病的发生方面也有重要的作用，如果能在自身免疫性疾病中识别出高表达的LncRNA和eRNAs，就可能会产生针对性的治疗。在治疗方面，LncRNA可通过改变增强子相关LncRNA的表达影响目标蛋白、治疗基因变异引发的疾病。综上所述，LncRNA可能会广泛应用于自身免疫性疾病的诊断、疾病活动性的评估、疾病风险及发病机制方面的评估以及治疗反应的预测等方面[28-31]。

6 LncRNA与系统性红斑狼疮的研究

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多系统损害的慢性自身性免疫性疾病，确切病因不明，可累及皮肤、浆膜、关节、肾及中枢神经系统等，病理表现为自身抗体及免疫复合物沉积[32]。Li等[33]发现，通过在SLE患者和健康对照者的T细胞中使用Agilent微阵列扫描仪(Agilent p/n G2565BA)扫描阵列，应用Agilent Feature Extraction软件评估LncRNA的表达谱，qRT-PCR结果显示SLE患者中uc001yk1.1和ENS-T0000044 8942表达下调，并发现 ENST00000-0448-942水平与抗Sm抗体相关。短期分析LncRNA的表达可能与SLE患者的疾病活动相关。Wu等[34]研究表明，血浆中的生长组织特异性转录体5(Growth arrest specific transcript 5，GAS5)、linc0597和Lnc-DC可以成为SLE潜在的生物标志物。该研究将病人分为SLE组和健康对照组，通过实验发现GAS5和Lnc-DC在SLE组中表达显著降低，而linc0597在SLE患者中过表达。该实验结果提示，GAS5和linc0597可能会有利于提高SLE的诊断准确性。Zhang等[35]通过研究探索了LncRNA NEAT1(NEAT1是构成核旁斑Paraspeckles的重要RNA)在SLE发病机制以及治疗方面的作用。该研究发现NEAT1在SLE患者中的表达异常增加,由p38活化引起NEAT1的表达增加，使SLE患者产生许多细胞因子和趋化因子，而当沉默NEAT1后趋化因子CXCL10及细胞因子IL-6的表达显著降低。此外，研究还发现NEAT1参与TLR4介导的炎症过程是通过影响晚期MAPK信号通路的激活而起作用。NEAT1表达与SLE患者临床疾病活动之间存在正相关关系。Yang等[36]研究探索了SLE发病机制的作用，实验选取SLE患者及健康人群，提取其外周血单核细胞通过聚合酶链反应法测定MALAT1的表达水平，发现SLE患者单核细胞中MALAT1表达异常增加。为了确定MALAT1对SLE患者单核细胞中IL-21的影响程度和在沉默信息调节因子 1 (Silent information regulator 1，SIRT1)信号通路中的作用，通过使用siRNA敲减MALAT1表达发现SLE患者单核细胞中IL-21的表达显著降低。该实验同时发现MALAT-1通过调节SIRT1发挥其致病作用，MALAT-1是SLE发病机制中的关键调控因子，同时也为治疗提供了新的靶点。

7 LncRNA与类风湿性关节炎的关系

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、以进行性关节侵蚀破坏为主的系统性自身免疫性疾病，未经正规治疗，可导致关节畸形、功能丧失[37]。其病理特点是滑膜细胞病变，包括成纤维细胞样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes，FLS)增生、血管新生异常和免疫细胞渗透[38]。FLS细胞是形成滑液和滑膜基质的关键细胞，在维持正常的关节平衡中起着重要的作用，而异常的FLS细胞增殖后产生消化蛋白酶和炎症因子进而破坏骨和软骨[39]。大量研究证明，FLS的大量增殖与炎症信号通路的异常激活有关，而非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)同样可调节FLS的增殖，如miR-152的过度表达减少了FLS的增殖[40]。Lnc-IL7R通过增强RA中zeste homolog2表达来增强FLS的增殖。Lnc-IL7R被其激活后消除由其介导的炎性反应，提高细胞增殖和细胞周期的连续性，阻止FLS的凋亡。当Lnc-IL7R过表达时，通过进一步提高FLS的增殖来抑制炎性反应。Cui等[41]研究也同样表明Lnc-IL7R可促进细胞增殖和细胞周期进程并抑制FLS细胞凋亡，提示Lnc-IL7R将来在RA治疗方面可能会发挥一定的作用。另外LncRNA还可通过调节滑膜细胞的迁徙和入侵来影响RA，如锌指结构反义转录本1(Zinc finger antisense 1,ZFAS1)从转录后水平进行调节以促进RA患者中FLS的迁移和入侵，而shRNA明显抑制了RA患者中FLS的迁移和入侵[42]。

研究表明，目前发现3个LncRNA(S5645.1,XR-006437.1,J01878)与RA高度相关，并被认为是诊断和治疗目标疾病的标志物。据Adami报道，Wnt信号通路在RA的发展中起到了关键性作用，可能作用于FLS激活、炎症调节、骨再吸收、骨重塑及关节毁坏等[43]。Muller等[44]观察表明，根据RA患者中CD14+单核细胞中的LncRNA在抗TNFα和抗IL-6治疗前后的浓度变化，发现了LncRNA参与类风湿性关节炎的发病机理。Lu等[45]发现RA患者的T细胞中LOC100652951和LOC100506036的表达水平增加。 通过使用生物制剂，RA 患者T细胞中的LOC100652951的表达水平降低。T细胞的活化增加了LOC100506036的表达，其可以调节鞘磷脂磷酸二酯酶1(Sphingomyelin phosphodiesterase 1,SMPD1)和活化T细胞核因子1(Nuclear factor of activated T cells 1，NFAT1)等基因，并可能引发RA的炎症反应，提示LOC100652951和LOC10050-6036可能会成为RA的靶向治疗目标。Zhang等[46]研究表明，LncRNA HOTAIR的过表达通过抑制p65进入细胞核而显著抑制由脂多糖处理的软骨细胞中核转录因子-κB，引起IL-1β和TNF-α的下调。 体内实验也表明HOTAIR的过度表达通过上调Ki67和增殖细胞核抗原(Prolife rating cell nuclear antigen，PCNA)减少了CD4+IL17+和CD4+IL23+细胞数量，并下调p-p65、IL-1β和TNF-α表达，进而增加了RA大鼠的细胞增殖和抑制了炎性反应。提示LncRNA HOTAIR的调节将来可能会成为RA的治疗新策略。夏英等[47]发现，与REL(NF-κB家族成员)、Smads蛋白家族(Drosophila mothers against decapentaplegic protein 3，SMAD3)和原癌基因ETS1(E26 transformation specific sequence 1)相关的LncRNA，包括NONHSAG0 27875、FR378506 和NONHSAT031501等也可能参与了RA的发生。

8 展望

现有的证据表明，LncRNA在自身免疫性疾病中具有重要的调控功能。但目前只认识到少数的LncRNA的功能及特点，还有许多的作用目前尚未阐明。在自身免疫性疾病中，已知LncRNA的表达是异常的，其潜在的机制尚不明确；自身免疫性疾病恶化的过程中，是否改变了LncRNA的作用；通过对LncRNA的调节来治疗自身免疫性疾病是否具有有益的效果。我们需要将功能性的LncRNA整合到自身免疫系统中，通过进一步的研究来加深对疾病发生发展和发病机理的认识。