检验猪场免疫效果的方法

朱连德

（北京中科基因技术有限公司，北京 海淀 100081）

效果评估疫苗免疫已成为猪场疫病防控的主要手段，尽管非洲猪瘟令养猪从业者和兽医的生物安全意识有了很大改变，但猪场对疫苗的期盼和依赖度依然很高，疫苗免疫成为猪场生物安全的最后一道防线。不管是已用疫苗的维持还是新疫苗的应用都需要免疫效果检验结果的支持。猪群接种后必须及时了解免疫是否合格，免疫的时机是否准确，免疫的次数和间隔是否合适，产生的免疫应答抗体是否足以抵抗外来病原微生物的侵害。如果这些问题都不清楚，养猪生产就会存在隐患。若猪群免疫无效或不合格，养猪从业者或兽医需知道应根据哪些指标或参数对疫苗选择和免疫程序修正做出决策。这需要从临床、生产到实验室数据的有效监控，正确检验、评估疫苗免疫效果。免疫效果需要利用多种方法综合检验评估而不是单一的方法，掌握这些方法不难，重要的是如何利用这些方法真实地反映出疫苗的有效性和免疫效率。

1 临床观察和生产成绩比较

这是最为经典和朴素的疫苗效果检验方法。猪场疫苗免疫后1月、3月、6月乃至1年，对应疫苗的疾病临床发生率大大下降或不再发生，生产成绩比应用疫苗之前明显提高，那能不能说疫苗免疫是有效的呢？通常人们会说是有效的，但考虑到猪场疫病发生、发展的规律及生产中采取的其他措施或环境、气候的改变，很难就疫苗免疫效果下结论。这是在肉眼观察和生产记录的基础上，做出的粗略估计。

2 临床对比试验

将生活在相同环境中的一批猪分成2组，一组用疫苗，另一组不用疫苗，以此对比方法检验疫苗是否有效。有的猪场可能连续对比2批或更多批的猪来评估疫苗效果。在生产过程中，尤其是新疫苗上市时，人们通常采用这样的方法评价疫苗效果并决定是否选择应用这个疫苗。很多疫苗企业在新产品上市后，会动员猪场做平行对比试验，免疫猪群与同等年龄和同样环境下的未免疫猪群比较，以此来证明疫苗的有效性。如果免疫猪群相对于未免疫猪群临床症状轻微或没有，生产成绩较好，通常认为免疫是有效的。可是即便免疫效果有效，那免疫效率如何，有多少猪产生了有效抗体，免疫保护率是多少，有效抗体能持续多久，对比试验依然不能明确回答这些问题。

3 哨兵猪试验

某些猪群，如后备猪群在免疫后，免疫应答反应是否抑制了其排毒，可以通过哨兵猪投入猪群后予以验证。哨兵猪是易感者，在免疫猪群中1周乃至数周没有相应疾病的临床症状，则说明疫苗免疫减少或消除了猪群病毒血症，猪群不再排毒或不具备感染能力。考虑到哨兵猪健康状况、环境等因素影响，这种试验也只能是养猪生产上的一种粗略评估，通常用于免疫净化方案实施的猪场。猪蓝耳病弱毒疫苗免疫的阳性猪场，尽量不要用哨兵猪试验方法。除了临床观察、生产成绩对比等之外，还有一种在实验室中检验疫苗免疫效果的方法，那就是攻毒试验。但在猪场内是断不可以这样做的，这会给养猪生产带来非常大的风险。

4 抗体检测

一般完成免疫接种程序后，可以通过检测血液中的抗体水平判断疫苗接种的效果，目前常用的有以下几种。

4.1 正向间接血凝试验(IHA)

其原理是将抗原(或抗体)包被于红细胞表面，成为致敏的载体，然后与相应的抗体(或抗原)结合，从而使红细胞拉聚在一起，出现可见的凝集反应。目前已有商用试剂盒，可以按说明书操作。猪瘟、猪口蹄疫抗体的检验均可采用此法。猪瘟弱毒疫苗免疫后血清血凝效价（或者说抗体水平）≥1∶16为免疫合格；猪口蹄疫灭活疫苗免疫后血清血凝效价≥1∶128为免疫合格。该方法也可以用于猪细小病毒抗体和猪流感病毒抗体的测定和检验。

4.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)

4.2.1 间接ELISA

其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原受检抗体复合物，再用酶标二抗（针对受检抗体的抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，用分光光度计定量测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。目前已经用于猪蓝耳病病毒抗体、猪瘟病毒抗体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌抗体的检测。百测（Biochek）对猪伪狂犬病gB和猪圆环病毒抗体的检测用的也是这种方法。

4.2.2 阻断ELISA

该方法是用抗原包被固相载体，加入待检样品，然后加入酶标单克隆抗体，最后加底物显色。呈色反应的深浅与样品中的抗原呈反比，主要用于测定抗体。猪瘟、猪伪狂犬病gE、猪口蹄疫、猪流感病毒抗体、猪传染性胃肠炎抗体检测均可用此法。

4.2.3 双抗原夹心ELISA

原理是将抗原固定在固相载体表面，抗体一个臂与该固定抗原结合，另一个臂与酶标或者金标的抗原结合，形成抗原-待检抗体-标记抗原的“夹心”，经显色剂显色，测出抗体水平。可用于猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒抗体等的检测。

4.3 血清中和试验（SNT）

这是一种用已知病毒测定血清中特异性抗体的方法。猪瘟、猪伪狂犬病、传染性胃肠炎、猪流行性腹泻等病毒抗体检测应用此法。目前商用ELISA试剂盒愈来愈多，操作方便，比较广泛地应用于疫苗免疫后抗体水平检测。

5 病原检测

疫苗免疫后，猪群是否存在病毒血症或菌血症，唾液、鼻分泌物、尿液、粪便等分泌和排泄物是否有病原，排毒持续多久，这也是评估疫苗免疫效果的方法之一。

5.1 PCR（聚合酶链式反应）方法

这是一种用于放大、扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，该技术将微量的DNA大幅增加。包含普通PCR、RT-PCR、RealTime PCR等。DNA病毒使用PCR，RNA病毒提取核酸后需要反转录，即RNA病毒使用RT-PCR。二者均可使用荧光PCR进行检测，大大提高检测的灵敏度。现在研发出一些常温下操作的快检设备。猪蓝耳病、猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒、非洲猪瘟等病毒均可使用PCR方法检测。目前非洲猪瘟的检测诊断主要是荧光定量PCR的方法，尚没有非洲猪瘟疫苗，便也谈不上检验评估了。

5.2 生物芯片

其是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子，比如核酸片段、多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。现在有生物芯片检测猪瘟、猪口蹄疫、猪伪狂犬病、非洲猪瘟、猪流行性腹泻病毒等，市场上也出现了高通量、现场检测的数字化生物芯片。

5.3 胶体金检测

常用的是“胶体金免疫层析法”，在检测带上可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用方便。胶体金技术适于猪瘟、猪口蹄疫、猪伪狂犬病、猪流行性腹泻病毒等血、尿液或粪便的检测，现在猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒的胶体金检测试剂盒以及多联检的胶体金试剂盒也已开始使用。

5.4 ELISA双抗体夹心法

连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中待检抗原分子上2个抗原决定簇结合，形成固相抗体-待检抗原-酶标抗体免疫复合物，加入该酶的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。可用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒等检测。此外，还有对猪体免疫系统检测的方法，譬如对细胞免疫应答的检测，干扰素、免疫细胞、免疫因子的变化，可以反映疫苗免疫应答情况，但目前主要在实验室研究用，尚未用于猪场生产的临床实践。

6 总结

上述检测方法中如今有不少商品化试剂盒和快检设备可用，并且随着第三方独立检测机构的出现，疫苗免疫效果的检验、评估也越来越专业、高效。作为猪场兽医或专家须科学、合理地制定试验方案、采样计划，正确地采样和处理样品，应用规范、正确的结果分析方法和判定标准。猪场疫苗免疫效果受疫苗质量、猪体免疫反应、其他疫苗与疾病的干扰、免疫时机和免疫操作等因素影响，在实际生产中，通过临床和生产成绩来确切地评估疫苗的免疫效果是不容易的，应该在猪群免疫后分2个、3个甚至更多时间段采样检测。采样设计是很关键的，譬如在检测群猪的抗体时，应在免疫时间轴上，选择2个或更多时间点采样检测抗体以了解抗体产生、消长变化。检测抗原，要注意避开弱毒疫苗病毒血症时间采样检测病原。

有些疫苗如猪圆环病毒疫苗免疫后，检测是否存在病毒血症，仅这一个参数是无法评定疫苗保护效果的。所以猪场应根据不同种类、不同性质的疫苗，确定不同的检验评估、实验室检测方法和相应的检验、评估参数，如发病率、死亡率、日增重、抗体/抗原阳性率、抗体合格率、合格抗体持续时间、变异系数CV值、排毒时长、循环Ct值等中的多个或全部参数。检验检测的方法很重要，猪场在选择试剂盒后，一定要清楚试剂盒适合的条件，不同试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等。此外，实验室检测是一个体系，实验室的环境条件、检测的标准操作程序（SOP）、检测方法、检测人员能力、检测用耗材试剂、仪器设备等都要合格、配套，仅注重精密和贵重仪器设备是不行的。疫苗免疫效果包含疫苗的有效性和免疫效率2个方面，因此猪场疫苗效果检验、评估，不能仅凭直觉、凭经验、凭肉眼观察和凭疫苗的口碑，应有真实的临床数据，正确的实验室检测数据，科学的分析评估标准，做到真正量化评估指标，使得猪群免疫管理和健康管理数字化和更加科学化。