肠道微生态影响绝经后骨质疏松症发生发展的研究进展①

李丽娟 林 静 王 凌

(复旦大学上海医学院附属妇产科医院暨妇产科研究所，复旦大学中西医结合研究院，上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室,上海200011)

肠道微生物自人出生后即被获得，成年人肠道中存在大约1014个细菌，其数量是人体细胞的10倍之多[1]。肠道微生物的基因超过5 × 106个，比人类基因数多150倍[2]，常与人类基因组共同起作用，被称为人体的“第二基因组”[3]。它还被认为是一种多细胞器官，以多种方式参与宿主相互作用并影响宿主[3]。研究表明，肠道微生物对宿主生物实现某些方面的生理功能来说是必不可少的，它可以促进难以消化的多糖代谢并产生必需的维生素，促进宿主的肠上皮和免疫系统发育分化，保护机体免受机会性病原体的侵袭，并且在维持组织稳态中起关键作用[4]。最近研究还表明[5]，人体内微生物群影响宿主其他组织的发育和稳态，包括骨组织。这为我们研究和治疗绝经后骨质疏松症提供了新思路。

在生理条件下，机体通过破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成间的平衡来维持骨骼稳态[6]。绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,PMO)是指绝经后妇女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，出现以骨量降低和骨组织的显微结构退行性变为特征，骨脆性和骨折易感性增加的一种全身代谢疾病[7]。在绝经后妇女中，骨质疏松引起的骨折比脑卒中、心肌梗塞等更为常见[8]。由骨质疏松引起的骨折具有破坏性后果，特别是在老年人中。 椎骨骨折是严重疼痛和跛足的根源，而髋部骨折仅在第一年就导致24%～30%的死亡率[9]。 此外，几乎50%的幸存者遭受永久性残疾[10]。据报道，超过50%的绝经后妇女患有骨质疏松性骨折，预计随着预期寿命的增长而增加。绝经后骨质疏松症因为它的高发病率和骨质疏松性骨折的严重后果，对家庭或社会造成了严重的负担，因此，我们需要采取积极的预防和治疗措施来应对该疾病[11]。

研究表明PMO中的骨质流失与宿主免疫反应密切相关，而宿主免疫反应又受到肠道微生物群的调控[12,13]。益生菌能够防止骨流失，从而在绝经后骨质疏松症中发挥积极地治疗作用[14,15]。肠道微生物对骨代谢的影响为PMO的管理提供了一个新的方式[16]。

1 女性雌激素衰退是绝经后骨质疏松症发生的重要诱因

Fuller Albright早在1940年发表了他对绝经期雌激素缺乏和骨质疏松症之间因果关系的观察结果，他介绍了更年期激素治疗(Menopausal hormone therapy，MHT)预防骨质疏松症的概念[17-21]。雌激素缺乏导致骨转化(吸收和形成)的速率增加，而骨吸收和骨形成的速率并不平衡，其中骨吸收更加占优势[22]。更年期的初始阶段，雌激素水平下降刺激较大程度的骨吸收和较小程度的骨形成，小程度的骨形成又造成一段时间内快速的骨损失。 初始阶段之后是一个更缓慢但更漫长的骨质流失期，这个时期主要影响到骨骼的皮质部分[12]。目前研究表明[23]，在一定的窗口期内，激素补充治疗的益处要大于它给机体健康带来的风险。

雌激素可以通过激活雌激素受体α、Wnt/β-Catenin 信号通路[24]或Notch 信号通路[25]来改善人骨髓间充质干细胞成骨分化的能力，进而起到调节骨代谢、保护骨组织的功能。Li 等[6]发现与没有骨质疏松症的患者相比，患有PMO的妇女TNF-α水平升高。 TNF-α和PMO患者体内的RANK(Recep-tor activator for nuclear factor-κB)水平呈高度正相关关系。在体外，TNF-α通过激活NF-κB(Nuclear factor-κB)信号通路和PI3K/Akt信号通路来促进破骨细胞分化因子(Receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)诱导的破骨细胞分化生成。 此外，PI3K/Akt的抑制完全阻断了TNF-α对NF-κB信号通路的活化和促破骨细胞生成的协同作用，表明TNF-α通过激活PI3K/Akt信号通路协同促进RANKL诱导的破骨细胞分化生成，最终在PMO发生发展中起重要作用。

在小鼠中，卵巢切除(Ovariectomy，OVX)通过促进初始CD4+细胞分化为成熟Th17细胞来增加Th17细胞的数量，这是细胞因子如TGF-β、IL-6、IL-1β和TNF驱动的结果，这些因子都是由于雌激素缺乏而诱导产生的[26]。Th17细胞是CD4+细胞中的一类能促进破骨细胞分化的亚群[12，27]，通过分泌IL-17A、IL-1、IL-6、RANKL、TNF以及低水平的IFN-γ有效地诱导破骨细胞的生成。 IL-17A刺激成骨细胞释放RANKL，并通过上调RANK从而促进破骨细胞的分化。在PMO患者中可以观察到IL-17的血清水平升高。此外，雌激素可以直接抑制CD4+T细胞向Th17细胞的分化。沉默IL-17R 或抗IL-17抗体能够预防OVX诱发的骨质流失，这一结果突出了IL-17在骨质流失中的重要性。总之，性激素缺乏能够促进Th17细胞的分化成熟，联合升高的TNF-α、RANKL、IL-17等细胞因子，导致PMO的发生[28]。

雌激素缺乏是绝经后女性发生骨质疏松症的主要风险因素，50岁以上的女性中有一半在其一生中会经历与骨质疏松相关的骨折。以往雌激素补充疗法一直是本病的主要治疗方法，它可以缩短破骨细胞(Osteoclast,OC) 寿命，减少绝经后妇女体内 OC 生成，增加 OC 凋亡，抑制骨重吸收[29]，由于雌激素补充疗法有一些令人无法接受的副作用(如增加子宫内膜癌的患病风险)，所以新型疗法仍被需要来对抗绝经后骨质流失。

2 肠道微生物在性激素缺乏引起骨质流失的发生中处于中心地位

数以万亿计的微生物栖息在肠道内，与宿主形成互利关系[30]。 这些共生微生物被称为微生物群，整体上可以看作是一种多细胞器官，以多种不同方式与宿主进行物质交换和信息交流[16,31]。甚至有人提出肠道微生物群是我们的“第二基因组”，动态整合宿主及其环境的信号，影响机体健康和患病风险[3]。

肠道微生物群在调节骨骼健康方面发挥重要作用[32]，肠道微生物群在性激素缺乏引起的骨质流失的过程中处于中心地位[25]。在无菌(Germ-free,GF)小鼠中，即使在性激素缺乏的情况下，破骨细胞生成因子[如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、TNF、IL-1]的产生也不会增加，即不能刺激骨吸收或引起骨质流失。此外，用益生菌鼠李糖乳杆菌GG(LGG)或市售益生菌增补剂VSL#3(益生菌制剂的商品名，含有8种益生菌)每周两次治疗性激素缺陷小鼠能降低其肠道通透性，减轻肠道和骨髓炎症，完全防止骨质流失的发生；相反，补充大肠杆菌的非益生菌菌株或突变体LGG并不具有保护性。上述实验表明[28]，肠道微生物群和肠道通透性增加在触发炎症途径中发挥重要作用，这对于在性激素缺陷小鼠中诱导骨质流失的作用至关重要。降低肠道通透性的益生菌有潜力成为PMO的治疗策略。

在GF小鼠中，性激素缺乏不会促使产生TNF的T细胞增生，也不会增加骨髓和肠中TNF的产生。此外,在微生物群缺乏的情况下,性激素缺乏时骨髓和肠组织中的IL-17 水平亦没有增加。综上所述，肠道微生物群的调节是性激素缺乏诱导骨质流失所必需的中间环节。另一些研究表明[33]，通过抗生素治疗改变肠道微生物组成的多样性和数目可以调节性激素缺乏雌性小鼠的骨质流失量。总之，肠道菌群与性激素缺乏引起的骨质流失密切相关。

3 肠道微生物调控骨代谢的机制

肠道微生物可以通过影响宿主的代谢和免疫反应，来调节机体的骨代谢，从而在PMO的发生发展中发挥重要作用。

3.1 肠道微生物通过宿主的免疫系统调控骨代谢 与肠道相关的炎症和自身免疫病症与骨量降低有关，提示肠道与骨代谢之间存在关联[34]。 肠道微生物被证明可以调节肠道和全身免疫反应[12]，并且已经确定免疫系统与骨代谢之间存在关联，表明肠道微生物可能通过改变机体的免疫反应影响骨代谢[13]。

小鼠免疫系统发育的最重要触发因素是出生后立即暴露于微生物组分。Hansen等[35]的研究表明,出生后短期 Germ-free的存在永久改变了Treg、NK 和 NKT 细胞的水平以及细胞因子的产生，即肠道微生物的延迟定殖导致免疫系统的永久性变化。总之存在时间窗口,能够通过肠道微生物的人工定植修改宿主未来的免疫表型。此外，肠道微生物的延迟定殖导致免疫系统的永久性变化。鉴于骨代谢与宿主免疫间的密切联系，以上研究提示，肠道微生物可能通过对宿主固有免疫的调控，间接影响骨代谢。

肠道微生物对CD4+T细胞亚群的出现和维持有强烈的影响。 比如分段丝状杆菌(SFB)能诱导Th17细胞的分化[36]、脆弱拟杆菌诱导Th1细胞和Treg的分化[37]，表明肠道的微生物和宿主细胞之间存在着密切的关联。

Sjögren等[5]研究发现，与常规培养的(Conven-tionally raised，CONV-R)小鼠相比，无菌(Cerm-free，GF)小鼠表现出更多的骨量，这与骨中破骨细胞数量的减少，从而使骨吸收减少相关。将CONV-R小鼠肠道微生物群移植于GF小鼠肠道内可其使骨量正常化。此外，GF小鼠的骨髓中CD4+T细胞和破骨细胞前体细胞的数量降低，同样，这种差异可以通过移植正常肠道菌群来消除。与CONV-R小鼠相比，GF小鼠的骨中表现出炎性细胞因子表达的降低。总之，肠道微生物群能调节小鼠的骨量，并且可能是通过调节免疫系统来减少破骨细胞介导的骨吸收。

Atarashi等[38]研究发现，肠内微生物亚群如SFB、柠檬酸杆菌、大肠杆菌O157和某些细胞外病原体的定殖并黏附到肠上皮细胞(Epithelial cells，ECs)时，肠Th17细胞被诱导并聚集。 也就是说，微生物黏附到ECs是 Th17细胞被诱导的关键线索。而前面我们已经知道IL-17 是引起骨量丢失的重要炎症因子,所以可以进一步推断肠道微生物确实是通过影响宿主的免疫系统来调控骨代谢的。

3.2 肠道益生菌可以通过抑制炎症反应来防止骨质流失 益生菌被定义为在给予足量时能带来健康益处的活微生物。益生菌除了能调节宿主的免疫应答[39]，还可以改变肠道微生物群的组成和代谢活性[40]，并且能增强上皮屏障功能，后者可能是最重要的机制[41]。

在细胞水平上，性激素缺乏引起骨丢失的重要机制是破骨细胞形成和破骨细胞寿命的增加[42，43]。 增加破骨细胞生成的主要驱动因素是免疫因子RANKL和TNF的产生增多[44]。 因此，依赖于性激素缺失的骨丢失被认为是一种炎性骨丢失。

Ohlsson等[45]的研究中选择了单纯 L-副干酪乳杆菌DSM13434(L-para)和L-副干酪乳杆菌DSM13434、植物乳杆菌DSM15312、DSM15313乳杆菌构成的乳杆菌混合物(L-mix),并且在OVX手术前的2周就开始分别用这两种组合的益生菌来喂养小鼠。 L.para和L.mix处理都能保护小鼠免受OVX诱导的骨质流失。益生菌治疗减少了两种炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的表达，并增加了OVX小鼠骨中骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)。OPG是RANKL的诱导受体[46]，通过与RANKL的结合减少破骨细胞的产生，是破骨细胞生成的有效抑制剂。

Britton等[32]也已经报道了益生菌的骨保护作用，他们测试了罗伊氏乳杆菌对OVX诱导的骨丢失的作用。结果显示罗伊氏乳杆菌治疗改变了肠道微生物的组成，在体外抑制破骨细胞的生成，防止了卵巢衰竭诱导的骨吸收。此外，益生菌的治疗抑制了OVX诱导的骨髓CD4+T细胞的增加，支持了肠道微生物通过调节骨中的免疫状态从而影响破骨细胞介导的骨吸收的观点。

Parvaneh等[17]的一项研究中，也证明了益生菌长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)能从OVX诱导的骨丢失中保护大鼠。

生物多样性下降被认为是疾病状态的一个指标，反映出生存环境恶化和资源枯竭[47]。雌激素的缺失导致微生物群落多样性降低，而随着益生菌的使用，肠道中的微生物多样性将增加[48]。肠道微生物群与肠壁之间相互作用的失调在性激素缺陷小鼠中诱导炎症和骨质流失中起关键作用。

3.3 肠壁通透性和骨质流失 肠上皮是宿主和肠腔微生物群之间的界面。肠通过细胞间隙的大小控制肠腔和黏膜下层之间的分子运输，这个选择性生理屏障能够阻挡较大直径分子通过。肠壁与肠腔微生物密切接触，不断识别肠腔内的外来抗原并对之做出反应[49]。增加的通透性允许更大的分子和潜在的抗原进入上皮黏膜下层，这可能引发异常的肠道和机体炎症反应[50]。因此，维持肠腔和黏膜下层之间紧密的机械屏障对健康至关重要。另外破骨细胞生成细胞因子是由驻留在肠上皮下组织中的免疫细胞产生，任何肠通透性改变都可能提高破骨细胞生成细胞因子水平从而影响骨密度。

性激素对维持肠腔内常驻菌群和肠壁黏膜下层之间生理屏障的紧密性起重要作用[51],所以性激素水平的降低将增加肠道通透性。因此,任何可以改善肠道通透性的治疗方法都将有利于预防性激素缺失导致的骨质流失。益生菌即是通过降低肠道通透性的途径来降低炎症反应从而起到保护骨的作用。

3.4 肠道微生物通过影响机体的代谢来调节骨代谢

3.4.1 肠道微生物群诱导IGF-1并促进骨形成和生长 Yan等[52]研究发现，尽管将常规的无特定病原体( Specific-pathogen-free,SPF) 的肠道微生物群移植于GF小鼠肠道内会导致宿主骨量急剧降低,但在微生物长期稳定定植的小鼠肠道内移植SPF,宿主中骨形成和骨量增加将占主导地位,导致骨骼纵向和横向的双发展。经检测,后者小鼠血清中胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factors,IGF-1)显著上升。IGF-1是一种对骨骼生长有明确正向调节作用的激素,同时可正向反映肠道微生物的定植状况。后者小鼠的肝脏和脂肪组织中IGF-1产量亦显著增加。相反，给常规小鼠以抗生素治疗会降低血清IGF-1并抑制骨形成。

尽管目前尚未见“肠道微生物-IGF-1-骨代谢”调控轴的报道，鉴于IGF-1在骨代谢过程中的重要作用，有理由推断肠道微生物可能通过调控与骨代谢密切相关的IGF-1水平，参与调控机体骨代谢平衡[53]。

另有研究表明，与GF小鼠相比， SPF小鼠的新生儿生长更快，其IGF-1水平更高。 此外，他们发现，在营养不足的情况下，用特定的细菌菌株如乳酸杆菌使肠道菌群单一化足以改变“生长激素-IGF-1轴”并对小鼠的骨生长产生积极影响[54]。

3.4.2 短链脂肪酸通过影响IGF-1 的水平来间接影响骨代谢 同样在Yan等[52]的研究中，用短链脂肪酸(Short-chain fatty acids， SCFAs)补充给抗生素处理过的小鼠，会促使IGF-1水平和骨量恢复至与未经抗生素处理的小鼠相同的水平。SCFAs包括乙酸、丙酸、丁盐酸等,可通过肠上皮细胞进入机体血液循环,影响宿主的免疫反应,抑制组蛋白脱乙酰酶的作用从而促进抗炎型细胞的作用，以维持免疫稳态。因此，SCFAs的产生可能是微生物群增加血清IGF-1的一种机制。肠道微生物群对骨骼提供合成代谢的刺激可能由IGF-1介导。大多数数据表明微生物群体诱导宿主IGF-1合成以影响其生长。

SCFAs能够诱导IGF-1的产生，它是益生元发酵的主要产物，赋予人体健康诸多益处，如免疫调节，SCFAs能够将脂多糖刺激单核细胞产生的细胞因子调节为抗炎细胞因子。

3.5 肠道微生物可以通过影响机体的营养状况来影响骨代谢 影响肠道黏膜的营养摄取可能是微生物对骨重建发挥作用的重要机制。肠道微生物群在食物消化吸收、能量供应和调节维生素的生成和吸收方面起关键作用。 对GF和CONV-R进行比较的研究表明，微生物群可促进肠道单糖的吸收，并诱导宿主对能量的摄取和储存[55]。此外，肠道微生物群合成维生素B和K族维生素[56]，因此有助于确保人体有足够的维生素摄入量，特别是在食物摄入不足或不良饮食习惯所造成的营养不良的情况下。 肠道微生物群也调节钙的吸收，这可能是通过改变腔内pH值和增加钙溶解度来实现的[57]。 因此，肠道微生物通过对营养摄取和能量捕获的作用可以促进宿主骨骼健康。

在营养不良的情况下，移植乳酸杆菌菌株将会促进果蝇幼虫生长，这是在最近的一项研究中发现的营养不良时微生物群对生长轴的影响[58]。将肠道中只有植物乳杆菌(Lp)WJL菌株或NIZO2877菌株存在的幼年小鼠和GF幼年小鼠以断奶或缺乏营养的饮食饲养， Lp WJL或Lp NIZO2877幼体的体重和身长比GF幼体有更显著的增长；并且Lp WJL组比Lp NIZO2877组具有更显著的增长，相应的体重、身长和股骨长度增加有2倍之差。有趣的是，两种菌株之间的定量差异并不是由于食物和卡路里摄入量的差异造成的。因此，植物乳杆菌的生长促进作用似乎是菌株特异性的，这会进一步使我们理解益生菌对微生物群和骨的影响。

4 总结与展望

肠道微生物在骨代谢的调节中发挥着重要的作用，它在绝经后骨质疏松症的发生发展中处于中心地位，这为绝经后骨质疏松症的预防和治疗提供了新的思路。肠道微生物可以通过影响宿主的免疫反应和炎症反应、影响营养物质的吸收以及通过益生菌的保护作用来实现对骨代谢的调节。目前对肠道微生物影响骨代谢的研究还不是很透彻，很多都是基于表型的研究，分子机制尚待进一步的揭示。我们有理由相信在未来肠道微生物将会在包括绝经后骨质疏松症等多种疾病的治疗中成为新的重要靶点。