药物代谢诱导毒性的体外预测方法研究进展

孙亚奇 ，陆启荣 ，刘爱梅 ，刘振利 ，王 旭 ，潘源虎 ，袁宗辉

（华中农业大学1.动物医学院，2.国家兽药残留基准实验室，3.农业农村部食品兽药残留检测重点实验室，湖北 武汉 430070）

现代药物开发流程先是确定药物的作用靶点，然后根据靶点设计出先导化合物，接下来是精心优化选择的先导化合物，在体内外进行药动学、毒理学和药效学测试，最后是临床前和临床研究［1］。数据显示，5000种候选化合物中大概只有1种可以上市。每一种药物的开发成本接近26亿美元，其中很大一部分归因于候选化合物的失败［2］。候选药物失败的最主要原因为毒性和严重的不良反应。外源化合物对人和动物体的毒性作用不仅是由本身引起的，还可能是母体化合物代谢为毒性代谢物（包括主要代谢物和微量代谢物）引起的。非尔氨酯（felbamate）的毒性是由其通过醛脱氢酶和谷胱甘肽结合途径所产生的活性代谢物引起的，而人体内的醛脱氢酶和谷胱甘肽转移酶是大鼠的5倍，这就是为什么在临床前研究中未观察到非尔氨酯毒性的原因［3］。为增加药物开发成功的机会，对药物及其代谢亚组的整体毒性进行预测评估是筛选潜在毒性化合物的必要步骤，且可降低药物的开发成本，减少药物毒性的发生，从而为开发出药理活性好、安全性高和毒性低的药物提供技术支持。

1 计算毒理学（in silico Toxicology）方法预测化合物毒性

动物模型在传统的毒性预测中一直发挥着重要的作用，它可直观地反映药物在体内的生物转化以及对动物机体的毒性作用，但动物模型价格昂贵，耗时，通量低，更重要的是由于种属差异，从实验动物获得的数据并不能准确对人类进行预测。近年来，随着计算机技术的飞速发展，计算毒理学方法应运而生。计算毒理学是基于统计学、化学和生物信息学等学科，借助数学模型和计算机等构建计算毒理学模型，评估化学物质的环境暴露以及对危害与风险进行高效模拟预测。它使用计算资源（即方法、算法、软件和数据等）来组织、分析、建模、模拟和可视化预测化合物的毒性［4］。它与计算药理学相互交织，使用计算工具的信息来分析药物的有效性和毒性。计算毒理学方法现已广泛应用于新药研发的早期筛选阶段，用来预测先导化合物和候选药物对人体产生的代谢毒性。

Fashe等［5］使用计算毒理学预测得到毛果天芥菜碱（lasiocarpine）和倒千里光碱（retrorsine）的C3位置和克氏千里光碱（senkirkin）的C26位最有利于羟基化从而导致其有毒代谢物的产生。Moorthy等［6］以查耳酮为原料，采用环化法合成了一系列黄酮衍生物，对合成的化合物使用计算毒理学方法预测了代谢和毒性。预测结果表明，具有羟基官能团的化合物发生硫酸盐和O-葡萄糖苷酸结合反应，甲氧基衍生物进行去甲基化反应。该衍生物活性化合物在致癌、致畸和致敏感等方面均无毒性。Chavan等［7］对帕博昔布（palbociclib，PAB）进行了体内体外代谢研究，在体内共检测到14种代谢物。为确定这些代谢物的毒性潜力，使用TOPKAT和DEREK软件进行了计算毒理学毒性预测。预测结果表明，所有代谢物（M2，M9和M14除外）均显示出高毒性。Gonzalez-Marino等［8］研究了新烟碱类杀虫剂尼替吡喃（nitenpyram，NPY）在紫外线和太阳照射下在水溶液中的光降解，以评价其在环境中的稳定性及转化产物的毒性。在计算毒理学毒性评价中发现，其中大多数转化产物具有高于NPY的急性毒性。Rudik等［9］创建了web应用程序MetaTox（http：//way2drug.com/mg），用于预测代谢物的毒性，可对生成的每一种代谢物进行急性毒性（基于GUSAR软件预测）、特殊毒性和不良反应（基于PASS软件预测）的评估，预测准确率高达90%。

在过去的几十年中，定量构效关系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型已被用于计算毒理学预测化合物结构与药效、毒性之间的关系。它的最大特点是可利用已知化合物的结构和信息建立构效关系模型，然后通过此模型预测结构类似化合物的药效和毒性。该法由于它的高通量性可极大地提高药物筛选效率，降低药物研发成本，缩短实验周期，减少动物模型的使用。

蒋慧等［10］采用QSAR方法预测兽药喹烯酮（quinocetone，QCT）及其代谢物的毒性。首先，通过查阅文献建立喹烯酮代谢基团，然后利用计算机辅助药物分子设计方法对其毒理活性进行比较分析。用ADMET Predictor 6.5预测原形及代谢物代谢组群的毒性。最后，将预测结果与文献报道的数据进行比较，探讨动物体内喹烯酮毒理活性的关键物质。预测结果表明，代谢组群中6种化合物（QCT，4-DQCT，1-DQCT，QCT-M10，QCT-M12和QCT-M15）具有生殖毒性，而另14种化合物则否，预测结果与文献报道的数据基本一致，说明该方法在预测代谢物毒性方面具有可行性，可以为喹烯酮后续代谢毒理学研究提供技术支持。Dmitriev等［11］基于早期对药物代谢预测的经验以及对啮齿类动物急性毒性的研究，采用QSAR方法建立了一种将代谢物预测与整体毒性评估相结合的计算方法。该法考虑了母体化合物及其毒性最强的代谢物的特性，从而找到了预测数据与已发表数据之间的最佳对应关系。然后以抗癫痫药物非尔氨酯为例，验证了该法的可行性。Liu等［12］利用统计算法建立基于分子结构训练数据集及其相关性质或毒性数据的QSAR模型。首先，通过数据库和文献检索确定了与临床肝损伤相关的植物性药物及其主要植物化学成分。然后，用计算毒理学QSAR对植物化学物质及其代谢产物的肝毒性（如肝转氨酶升高）进行了预测并与文献报道进行了比较，预测结果准确可靠。

计算毒理学在预测药物代谢毒性上，可显著地降低成本，节省时间，从而降低药物开发后期的损耗率。可应用于新药研发的早期筛选阶段，用于化学物的毒性预测及风险评估优先级分级。但计算毒理学模型的建立高度依赖于实验数据，而现有实验数据的不一致性可能导致预测模型的不准确性［13］。另外，计算毒理学模型的不准确性还可能由于所收集的多种数据的实验条件不同、数据集不平衡所造成［14］。

2 肝样细胞模型预测化合物毒性

近年来，许多新兴的体外技术发展迅速，他们被用来做代谢诱导的毒性研究具有高通量、快速、价廉的优点［15］。传统体外毒性预测模型包括分离的肝切片［16］、原发性肝细胞［17］、转化的肝癌细胞系、表达P450的永生化肝细胞［18］以及人肝微粒体（human liver microsome，HLM）和分离重组细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）亚型。肝细胞和肝切片与体内系统最为相似，低温保存的原代肝细胞保持了原有结构和大多数体内功能，已广泛用于体外药物检测，被认为是药物筛选的金标准［19］。原发性肝细胞含有大量的药物代谢酶，但难以培养和维持代谢酶的生理水平，价格昂贵。普通肝细胞易于培养，但缺乏代谢化合物的能力。

3 高通量芯片模型预测化合物毒性

为适应当今世界新药研发的速度，尤其需要开发一种高通量、高效率的代谢毒性模型。广大科研人员基于这一理念，研发出了一系列具有芯片模型筛选特性的体外代谢致毒预测模型。Yu等［20］开发了数据分析毒理学芯片（DataChip）和代谢酶毒理学芯片（MetaChip）技术，它们将代谢和基于细胞的筛选联系起来。DataChip是一种功能化微柱芯片，支持Hep3B人肝癌细胞的三维微阵列。MetaChip是一种含有在人肝中发现的固定化代谢酶的微孔芯片。为验证在芯片上原位生成化合物代谢物和快速评估其毒性的概念，将22个模型化合物分配到MetaChip中，并与DataChip夹在一起。芯片平台获得的半数抑制浓度（inhibitory concentration 50，IC50）与大鼠半数致死量（lethal does 50，LD50）、人Cmax和药物性肝损伤类别相比较，预测体内药物不良反应。该平台在IC50和Cmax的最佳截断点处具有100%敏感性、86%特异性和93%总体预测能力。因此，DataChip/MetaChip平台可作为常规体外多孔平台的高通量、早期、微尺度替代品，为药物开发早期代谢诱导毒性提供快速、价廉的评估。

肝中各种药物代谢酶（drug metabolic enzymes，DME）的差异表达可能导致个体药代动力学参数的变化，从而导致药物在个体间的毒性差异。Kwon等［21］开发出“转染酶和代谢芯片”（TeamChip）技术，它可预测代谢诱导的药物毒性。TeamChip是通过将含有药物代谢酶的微孔芯片打印到含有微型三维细胞微阵列的微柱芯片上制备的。使用该芯片的用户能选择单个或多人的代谢酶基因（如CYP3A4，CYP2D6，CYP2C9，CYP1A2，CYP2E1和UGT1A4）在THLE-2细胞微阵列表达。为鉴定与药物解毒有关的特定酶，作者在单个微阵列上以组合方式创建了84种代谢酶基因表达的组合。因此，TeamChip平台可对代谢诱导的待测化合物的毒性进行高通量分析。

高通量芯片技术可对药物代谢诱导毒性进行快速、高效、准确的评估，在新药早期开发阶段尤为重要。它可部分替代动物实验，减少实验动物的使用，虽然该模型仍处于研究阶段，尚未正式应用于临床，但随着科技的发展和技术的进步，高通量芯片模型必将成为未来代谢毒性预测的一个发展方向。

4 三维细胞培养预测化合物毒性

三维（three dimension）立体细胞培养是近年来在二维（two dimension）单层细胞培养的基础上发展起来的更接近于人体真实细胞的一种培养方法，常被用于肝毒性检测，也可用于药理与毒理学的其他领域。由于二维细胞培养模型缺乏组织和器官的三维结构因而不能充分模拟体内细胞的生长微环境，不能代表细胞在体内的生理状态，因此在反应药物肝毒性上缺乏敏感性。而三维细胞模型则正好解决了这个问题。它在体外将具有相似组织结构的三维生物材料（即具有各种化学性质的水凝胶基质中的类有机化合物、微组织、小球和细胞）与各种细胞共培养，从而使细胞可在立体空间结构中迁移和生长。三维细胞模型可模拟体内细胞微环境，能使原代肝细胞维持高水平的特异性基因表达，通常能表现出更好的细胞形态学和生理学特征。因此，越来越多的研究转向使用三维细胞培养技术来开展药物早期毒性筛查。Yu等［22］对现有的高通量筛选检测方法进行改进，以评估代谢诱导的化合物毒性，开发了一个384孔板平台，该平台使用三维细胞培养技术进行细胞培养。将海藻酸盐和基底凝胶混合物中的人胚肾HEK293细胞打印在含有代谢酶的384孔板上，用试剂盒测定HEK293细胞的活力和膜完整性。结果表明，测得的Z’因子和变异系数分别＞0.6%和＜14%，说明在384孔板上建立的测定方法可靠性和重现性良好。

三维细胞培养技术主要包括三明治培养法、球形培养法和各种微流控或多器官生物芯片。

4.1 三明治培养

三明治培养是最常见的一种三维培养法，它可模拟肝细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）（如胶原蛋白、基质凝胶、壳聚糖、透明质酸和聚电解质等）之间的相互作用，使肝细胞在长期培养中保持肝的特异性功能。即将融合的单层原代肝细胞置于鼠尾胶原和胶凝的ECM之间来培养制成三明治培养模型［23］。这种模型可减少细胞骨架变化，降低细胞扁平度，同时稳定细胞与细胞间的接触。另外，在这种结构中，肝细胞保留了细胞极化、胆小管功能网络的形成以及相关转运蛋白的表达等特征和功能［24］。因此，该模型特别适用于肝胆输运和药物性肝损伤的研究。然而，随着培养时间的延长会导致CYP450活性的下调。当用于广泛的药物毒性筛选和代谢物鉴定时，预测准确率只有30%～50%［25］。总之，三明治培养被广泛应用于肝胆输运的研究，而它们在非胆汁淤积，尤其是长期肝毒性评估方面的应用有限。

4.2 球形培养

球形培养是在不黏附基质的情况下悬浮培养的肝细胞形成多细胞球体的一种培养方法。多细胞球体是在生物反应器中搅拌产生的细胞三维聚集体、悬滴培养物或超低附着表面上的重力聚集体，它能构成96孔的高通量筛选模型，且技术投入少［26］。从肝细胞系、原代肝细胞或干细胞衍生的肝细胞样细胞进行三维球形培养，可全面改善细胞表型和功能。与三明治培养相比，球形培养对药物肝毒性具有更高的敏感性。如大鼠椭球体对双氯芬酸、半乳糖胺、异烟肼、对乙酰氨基酚（扑热息痛）、间二硝基苯和3-硝基苯胺等6种肝毒性药物敏感。球形培养的细胞还能保持长期的细胞活性，维持肝细胞的极性并有Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶的表达［27］。因此，肝细胞球可应用于分析药物代谢物，以及研究药物的长期肝毒性。然而，许多研究缺乏球形培养对慢性药物毒性敏感性的系统评价。此外，大多数研究只将球形培养模型与二维肝细胞培养相比较，而缺乏与活体肝的比较。

4.3 中空纤维三维生物反应器

中空纤维三维生物反应器是一种更接近于体内肝形态的体外模型。尽管球形培养由于能在整体上很好地维持肝表型而备受欢迎，但它却不能提供灌注。然而血流动力学和剪应力已被证明对肝功能有深远的影响［28］。因此，为构建更接近体内肝复杂形态的体外模型，用于三维灌注的多室中空纤维膜生物反应器技术被开发用于额外的体内肝支持的大规模系统（800 mL）。中空纤维生物反应器技术由3个独立且相互交织的毛细管系统组成，用于动静脉介质的灌注、供氧和去二氧化碳。它能在数周内维持肝的表型和功能。当生物反应器接种肝细胞时，这些细胞在培养过程中自组装成组织样结构，包括新胆道和新窦状内皮化结构。该生物反应器体积仅有2 mL，对应1.2×108个细胞，可用于药物临床前检测［29］。然而，由于它需要大量的细胞（大约是单个球体细胞数的8万倍）阻碍了该平台用于中到大规模毒性研究。

4.4 器官芯片系统（Organ-on-a-Chip）

器官芯片系统是在微流控技术以及微加工细胞生物学的基础上发展而来。由于它是通过产生剪切力、生化浓度梯度等物理和化学刺激，使细胞能对这些刺激响应自组装，因此器官芯片系统更能表现出人体的真实生理功能［30］。经研究发现，外源物质经肝代谢产生的毒素通常对其他器官也会造成毒性。为研究这些器官之间的相互代谢作用机制，常用肝细胞或组织与其他器官进行共同研究。Choucha-Snouber等［31］构建了一种肝-肾共培养芯片，该芯片有2个细胞培养腔，一个含有肾细胞系（MDCK），另一个含有肝细胞系（HepG2或HepaRG）。结果表明，仅在MDCK细胞和HepaRG细胞（非HepG2细胞）共培养时，抗癌药物异环磷酰胺表现出肾毒性作用，说明其肾毒性作用是通过在HepaRG细胞中形成细胞毒性代谢物产生的。Oleaga等［32］设计了一种利用心、肌、肝（HepG2/C3A）和神经元单位开发灌注多器官芯片系统。用乙酰氨基酚、丙戊酸、多柔比星和阿托伐他汀4种已知对心脏、肌肉、肝等有特定作用的药物来评价该模型的有效性。作者进一步证明了这些多器官系统产生的数据与体内数据是一致的，表明该平台是研究某些药物多血管毒性反应的可行工具。最近，Miller等［33］提出了一个代表13个器官的多器官芯片系统，该系统能分离屏障和非屏障细胞。而且作者考虑了体内器官体积和流速，以使系统能模拟体内生理灌注。他们使用5种人类细胞系描述了该平台的性能，发现它们在1周内稳定可行。此外，他们还报道了CYP1A1和CYP3A4在此培养期间的酶活性，但这些多器官系统在表型、稳定性或对药物暴露的敏感性方面是否优于单器官培养仍有待证明。

综上，三明治培养可使肝细胞在长期培养中保持肝的特异性功能，适合应用于肝胆输运的研究，但在长期培养时，由于CYP450活性下调，并不适合长期肝毒性评估。球形培养能在整体上很好地维持肝表型，并伴有代谢酶的表达，可用于分析药物代谢物，以及研究药物的长期肝毒性，但不能提供灌注，未考虑血流动力学和剪应力的影响。而中空纤维生物反应器正好解决了这一问题，它更接近体内肝的复杂形态，能数周维持肝的表型和功能，具有代谢活性，可用于药物临床前检测，但由于它需要大量的细胞作为支持，因此不适用于大规模毒性研究。器官芯片系统考虑到人体的复杂性，将多个器官连接到单个芯片上，表现出更真实的生理功能。它已用来研究各器官组织之间的代谢及相互作用性、某些药物的多器官毒性反应等，但目前仍处于发展的起步阶段，仍需继续深入研究。

5 结语

本文主要介绍了计算毒理学、肝样细胞模型、高通量芯片模型以及三维细胞培养技术等新型体外代谢毒性预测模型。计算毒理学基于计算机技术、生物信息学以及现有的实验数据对先导化合物和候选药物对人体产生的代谢毒性进行预测，它能缩短研发周期，降低开发成本，提高新药开发成功率。但由于它高度依赖于现有的实验数据，因此应对实验数据进行严格审核和考察，以保证预测模型的准确性。高通量芯片技术利用生物化学以及细胞培养技术对一系列化合物的生物活性进行筛选和检测，能快速、高通量地对代谢毒性进行预测。当然，此模型的建立目前还处于初级阶段，仍需要继续进行深入研究。三维细胞模型可模拟体内细胞的生长微环境，很好地表现出细胞在体内的生理状态，尤其是中空纤维三维生物反应器以及器官芯片系统技术的开发，使得体外预测药物代谢与毒性更加准确真实。但在这些平台被广泛应用于临床时，需要对这些模型进行系统评估和验证。尤需要在细胞活力和稳定性、关键代谢以及信号通路等方面对平台进行比较。

基于高通量细胞培养以及芯片技术的发展、检测分析自动化的进步、新型实验平台的建立，开发一种更为高效、快速、准确的代谢毒性预测模型将为新药开发带来便利。